Derivazione di podociti renali umani da cellule staminali pluripotenti indotte: una procedura per la differenziazione diretta di podociti renali maturi da cellule staminali

Le cellule mature possono essere riprogrammate per riacquistare il loro stato indifferenziato e proliferativo simile a quello delle cellule staminali. Queste cellule riprogrammate sono chiamate cellule staminali pluripotenti indotte o IPSC. Per differenziare le cellule pluripotenti in cellule specializzate nei podociti coinvolte nella filtrazione dei rifiuti dai reni, iniziare assumendo una sospensione di IPSC umane in un mezzo di induzione del mesoderma.

Trasferire questa sospensione su una piastra di coltura rivestita di matrice basale e incubare. La matrice basale facilita l'adesione delle IPSC alla base. Successivamente, i fattori specifici presenti nei terreni inducono la differenziazione delle IPSC nelle cellule del mesoderma, le cellule precursori dei podociti. Aspirare il fluido esaurito.

Integrare la piastra con il volume desiderato di un mezzo intermedio di induzione del mesoderma e incubare per un periodo prolungato. Questo passaggio porta alla differenziazione delle cellule mesodermiche in podociti immaturi. Sostituire il mezzo intermedio di induzione del mesoderma con una soluzione di tripsina per dissociare le cellule aderenti dalla piastra.

Successivamente, centrifugare per pellettizzare le cellule. Eliminare il surnatante contenente la soluzione di tripsina e i frammenti della matrice. Risospendere il pellet in un mezzo di induzione podocitario. Trasferire la sospensione cellulare in una piastra di coltura rivestita di fresco. Incubare per consentire lo sviluppo di diverse sporgenze simili a piedi da cellule intermedie, con conseguente formazione di podociti maturi.

Dopo il conteggio, risospendere le cellule a una concentrazione di 1 volte 10 al quinto cellulare per millilitro di mezzo di induzione del mesoderma e aspirare la soluzione della matrice extracellulare dalle piastre rivestite della matrice della membrana basale a 2. Sciacquare le piastre due volte con un terreno caldo e miscelare la sospensione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo con un pipettaggio delicato.

Aggiungere 1 millilitro di cellule a ciascun pozzetto delle piastre a 12 pozzetti rivestite con matrice a membrana basale e agitare delicatamente le piastre per distribuire le cellule in modo più uniforme. Quindi, posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari. Nei giorni da 2 a 15 della differenziazione, sostituire il mezzo di induzione del mesoderma con 1 millilitro di mezzo di induzione intermedio del mesoderma per pozzetto.

Se si osserva una crescita cellulare sostanziale e un rapido esaurimento dei nutrienti, come indicato dall'ingiallimento del terreno, il volume del mezzo di differenziazione del mesoderma intermedio può essere aumentato a 1,3 millilitri per pozzetto. Il 16° giorno di coltura, sciacquare le cellule intermedie del mesoderma con un terreno caldo e incubare le cellule con 500 microlitri di tripsina-EDTA allo 0,05% per pozzetto per 3 minuti a 37 gradi Celsius.

Quando le cellule iniziano a dissociarsi, raschiare le cellule con un sollevatore cellulare e mescolare delicatamente le cellule mediante pipettaggio. Interrompere la reazione con circa 2 millilitri di soluzione neutralizzante della tripsina per pozzetto e trasferire le cellule in una provetta conica da 50 millilitri. Portare il volume fino a 50 millilitri con il terreno e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.

Risospendere il pellet e il mezzo di induzione dei podociti a una concentrazione di 1 volte 10 per millilitro di mezzo e aggiungere le cellule alle piastre rivestite di matrice a membrana basale 2. Quindi, agitare delicatamente la piastra per distribuire le cellule in modo più uniforme e posizionare le cellule nell'incubatore per un massimo di 5 giorni.

• Induced Pluripotent Stem Cells (IPSCs) - Reprogrammed mature cells with a proliferative, undifferentiated state similar to stem cells.
• Podocytes - Specialized cells involved in the filtration of waste from kidneys.
• Mesoderm Cells - Precursor cells for podocytes that are derived from IPSCs.
• Mature Podocytes - Fully developed podocytes, characterized by several foot-like projections.
• Directed Differentiation - A process of driving the development of undifferentiated cells into a specific cell type.

• Introduce Induced Pluripotent Stem Cells (IPSCs) - Cells which can be reprogrammed to regain a stem cell-like state (e.g., pluripotent).
• Key Concepts - Summarization of the steps from IPSCs to mature podocytes (e.g., directed differentiation of IPSCs, kidney mesoderm).
• Underlying Mechanisms - This involves various elements, such as media induction, cell incubation, and resuspension (e.g., deriving).
• Connect to Experiment - Understanding of how this process is valuable in studying kidney functions (e.g., podocytes kidney, normal human kidney podocytes).

• What are Induced Pluripotent Stem Cells (IPSCs) and how are they reprogrammed?
• What are podocytes and how do they function in the kidney?
• What is the process of deriving podocytes from mesoderm cells?

• Practical Applications - Generation of podocytes could be used in testing pharmaceutical effects on kidneys (e.g., kidney podocytes).
• Industry Impact - The research may offer new treatments for kidney-related diseases (e.g., human podocytes).
• Societal Importance - A better understanding of the IPSCs may revolutionize regenerative medicine (e.g., pluripotent).
• Link to Scientific Advancements - The evolution of technology that could manipulate cell development (e.g., directed differentiation of ipsc).