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0 visualizzazioni • 3:45 min • April 30th, 2023
Le cellule della muscolatura liscia detrusoria, o DSM, presenti all'interno della parete della vescica urinaria costituiscono l'unità funzionale primaria della vescica. Queste cellule si rilassano per facilitare l'immagazzinamento dell'urina nella vescica e si contraggono per rilasciare l'urina.
Per isolare le cellule DSM, inizia prelevando un campione di vescica urinaria umana prelevato. Lavare il campione per rimuovere eventuali tracce di sangue e detriti. Successivamente, fissare il tessuto con la superficie mucosa rivolta verso l'alto. Asportare il grasso, i vasi sanguigni e lo strato mucoso per esporre lo strato muscolare detrusore sottostante. Quindi, tagliare il tessuto privo di mucosa in piccoli frammenti.
Trattare i frammenti di tessuto con un cocktail digestivo contenente papaina e incubare. La papaina, un enzima proteolitico, promuove la digestione delle proteine nella matrice extracellulare che tengono insieme le cellule e avvia l'allentamento delle cellule nella matrice. Ora, rimuovi il surnatante contenente papaina.
Aggiungere la sospensione dell'enzima collagenasi ai frammenti di tessuto e incubare a temperatura fisiologica. La collagenasi rompe la matrice extracellulare e facilita la dissociazione delle cellule DSM. L'incubazione a temperatura fisiologica aiuta a preservare l'integrità delle cellule DSM. Eliminare il surnatante contenente collagenasi.
Lavare i frammenti di tessuto con un tampone ghiacciato per rimuovere eventuali enzimi residui. Quindi, risospenderli nel buffer. Triturare delicatamente i frammenti di tessuto trattati con l'enzima per garantire la completa dissociazione di tutte le cellule non rilasciate e ottenere una sospensione di cellule DSM a singola cellula. Conservare le celle DSM a basse temperature fino a nuovo utilizzo.
Iniziare esaminando il campione di vescica urinaria a tutto spessore. Fissare il campione, con la mucosa rivolta verso l'alto e sierosa verso il basso, su un piatto rotondo da 150 millimetri rivestito di enantiomero siliconico riempito di DS ghiacciato e rimuovere con cura tutta la mucosa mediante dissezione brusca.
Ritaglia diversi pezzi di muscolo liscio detrusore o DSM privi di mucosa. Mettere da 3 a 6 pezzi di DSM in un tubo con 1 o 2 millilitri di DS preriscaldato contenente papaina e ditiotreitolo o DS-P. Incubarli a 37 gradi Celsius per 30-45 minuti, assicurandosi di agitare la provetta ogni 10-15 minuti.
Dopo l'incubazione, rimuovere il DS-P dalla provetta e lavare brevemente i pezzi di DSM con DS ghiacciato. Trasferisci il DS con i pezzi del DSM in un nuovo tubo e rimuovi il DS, lasciando i pezzi del DSM sul fondo del tubo. Aggiungere da 1 a 2 millilitri di DS contenente collagenasi di tipo II o DS-C alla provetta e incubare a 37 gradi Celsius agitando di tanto in tanto.
Scartare il DS-C e lavare i pezzi DSM trattati con enzimi da 5 a 10 volte con DS ghiacciato. Dopo l'ultimo lavaggio, lasciare il DS all'interno del tubo e triturare delicatamente i pezzi con una pipetta Pasteur lucidata a fuoco per rilasciare singole cellule DSM.