Isolamento dei glomeruli: una tecnica per ottenere glomeruli intatti dal rene murino

Nei reni dei vertebrati, i nefroni sono costituiti da più glomeruli - una fitta rete di vasi sanguigni - che svolgono un ruolo primario nella filtrazione dei rifiuti dal corpo.

Per isolare i glomeruli, inizia prendendo un rene di topo appena sezionato. Usa una pinza per staccare la capsula renale dal rene e posiziona il rene pulito in un nuovo piatto di coltura. Ora, posiziona il piatto sul ghiaccio per evitare la degradazione dei reni. Tritare il rene in piccoli pezzi.

Quindi, risospendere i pezzi di rene tritati in una soluzione tampone adatta. Filtrare la sospensione tissutale attraverso un filtro a maglie di grandi dimensioni e raccogliere il flusso in un piatto fresco. Ripetere questo passaggio ancora un paio di volte, diminuendo progressivamente le dimensioni delle maglie ogni volta, fino a quando i glomeruli si dissociano dai frammenti renali.

Infine, lavare il filtro con il terreno di coltura desiderato per raccogliere i glomeruli più piccoli intrappolati mentre i frammenti di rene rimangono nel filtrato. Trasferire i glomeruli su una piastra di fissaggio ultrabassa. Visualizza la lastra utilizzando un microscopio a luce invertita.

Con l'aiuto di una micropipetta, catturare un singolo glomerulo e trasferirlo in un pozzetto fresco. Integrare il pozzetto con terreni di coltura e utilizzare il glomerulo isolato per ulteriori analisi.

Dopo aver liberato i reni come indicato nel manoscritto del testo, tenere il rene con la pinza chirurgica e utilizzare un altro paio di pinze per estrarre le capsule renali. Successivamente, posizionare i reni nei pozzetti di una piastra di coltura a 6 pozzetti contenente ciascuno 2 millilitri di HBSS e posizionare la piastra di coltura sul ghiaccio.

Quindi, trasferisci i reni in una capsula di Petri da 100 millimetri e usa due bisturi per tritarli in piccoli pezzi di circa 1 o 2 millimetri. Mantenere i pezzi di rene tritati bagnati con HBSS.

Quindi, posiziona i pezzi di rene sopra un setaccio di metallo da 300 micrometri e premi il rene attraverso il setaccio usando lo stantuffo di una siringa da 20 millilitri. Sciacquare ripetutamente il setaccio con HBSS e utilizzare una pipetta sierologica per raccogliere il flusso e trasferirlo in una capsula di Petri pulita.

Usa un bisturi per raschiare via tutto ciò che rimane sul fondo del setaccio e trasferiscilo nell'omogeneizzato di rene raccolto. Sciacquare l'omogeneizzato di rene attraverso un setaccio da 75 e 53 micrometri con HBSS. Quindi, lavare entrambi i setacci con HBSS per rimuovere tutte le strutture più piccole.

Raccogliere le strutture renali e il materiale che rimane nei setacci lavando la superficie superiore di ciascuno con DMEM integrato con il 20% di siero fetale di vitello e trasferire il materiale nei pozzetti di una micropiastra a 6 pozzetti con attacco ultrabasso.

Portare la micropiastra con attacco ultra-basso a un microscopio a luce invertita e utilizzare una pipetta da 20 microlitri per raccogliere singoli glomeruli incapsulati e/o decapsulati.