Isolamento degli esosomi: una tecnica di ultracentrifugazione basata sulla densità che utilizza un cuscino di saccarosio per separare gli esosomi dai terreni condizionati delle cellule in coltura

Gli esosomi - vescicole di dimensioni nanometriche legate alla membrana che trasportano biomolecole funzionali - sono attivamente secreti dalla maggior parte dei tipi di cellule e possono essere isolati da surnatanti di colture cellulari in vitro. Per isolare gli esosomi, in primo luogo, raccogliere il surnatante o il terreno condizionato da una coltura cellulare di interesse. I terreni condizionati conterrebbero esosomi, proteine, detriti cellulari e vescicole.

Centrifugare il terreno per pellettare i detriti cellulari. Raccogli il surnatante contenente esosomi e filtralo attraverso filtri cellulari per rimuovere le vescicole più grandi. Trasferire un volume specifico del mezzo filtrato in una provetta nuova. Successivamente, mescola le concentrazioni appropriate di saccarosio e ossido di deuterio per preparare un cuscino di saccarosio, un gradiente discontinuo di saccarosio.

Aggiungere un volume specifico della soluzione a cuscino di saccarosio nel tubo contenente il terreno; la soluzione forma uno strato separato sul fondo. A questo punto, centrifugare la provetta ad alta velocità. Il cuscinetto di saccarosio facilita la migrazione degli esosomi dal terreno alla soluzione di saccarosio, mantenendo l'integrità dell'esosoma. I contaminanti proteici ad alta densità occupano l'interfaccia tra la soluzione di saccarosio e il terreno.

Trasferire con cura la frazione principale dello strato di saccarosio contenente esosomi in una provetta nuova con un tampone adatto. Centrifugare ad alta velocità per ottenere un pellet di esosomi purificati. Scartare il surnatante contenente saccarosio insieme a qualsiasi contaminante proteico. Risospendere il pellet di esosoma in tampone e conservare a basse temperature fino a nuovo utilizzo.

Per pre-eliminare il mezzo condizionato raccolto, centrifugarlo a 500 x g per 5 minuti a 4 gradi Celsius. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo e scartare il pellet. Dopo aver ripetuto questa fase di centrifugazione con il surnatante recuperato, recuperare nuovamente il surnatante e scartare il pellet.

Quindi, centrifugare il surnatante recuperato a 2.000 x g per 15 minuti e 4 gradi Celsius. Conservare il surnatante e scartare il pellet. Filtrare il surnatante una volta attraverso un filtro da 0,22 micrometri collegato a una siringa da 20 millilitri in una nuova provetta da centrifuga.

Nel frattempo, per preparare una soluzione di saccarosio al 25% in ossido di deuterio, pesare accuratamente 1,9 grammi di saccarosio in un tubo universale. Quindi, aggiungere l'ossido di deuterio fino a quando il peso raggiunge i 7,6 grammi. Quindi, riempire una provetta per ultracentrifuga con 22,5 millilitri di terreno condizionato pre-cleared.

Inserire una pipetta di vetro nella provetta. Aggiungere 3 millilitri di soluzione di saccarosio attraverso la pipetta in modo che la soluzione formi uno strato separato sotto il mezzo condizionato. Posizionare con cautela il tubo contenente una soluzione di saccarosio a strati nel secchio di un rotore oscillante.

Fissare il secchio nel rotore. Posizionare il rotore nell'ultracentrifuga e farlo girare a 100.000 x g a 4 gradi Celsius per 1,5 ore. Prelevare 2 millilitri di strato di saccarosio dalla provetta, 1 millilitro alla volta, utilizzando una pipetta P1000 con la punta attaccata a una punta da 10 microlitri e aggiungerla a un flacone da ultracentrifuga contenente 20 millilitri di PBS filtrato per il lavaggio.

Posizionare la provetta in un rotore ad angolo fisso e centrifugarla a 100.000 x g a 4 gradi Celsius per 1,5 ore. Utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri per rimuovere con cura il surnatante. Risospendere il pellet con 400 microlitri di PBS filtrato.