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0 visualizzazioni • 3:04 min. • April 30th, 2023
Gli esosomi - vescicole di membrana di dimensioni nanometriche derivate da cellule - mostrano il potenziale come veicoli di somministrazione terapeutica per piccoli RNA interferenti a doppio filamento o siRNA.
Dopo il rilascio nel citoplasma della cellula bersaglio, il siRNA si lega al complesso di silenziamento indotto dall'RNA. Il complesso attivato quindi riconosce e si lega a mRNA specifico, regolandone negativamente l'espressione e mediando il silenziamento genico.
Per incapsulare il siRNA negli esosomi, per prima cosa, raffreddare una cuvetta di elettroporazione sul ghiaccio. Successivamente, mescolare gli esosomi e il siRNA specifico in una provetta nel rapporto desiderato utilizzando un tampone di elettroporazione adatto. A questo punto, trasferite il composto nella cuvetta pre-raffreddata.
Chiudere la cuvetta e posizionarla nel supporto della cuvetta dell'elettroportatore. Ruotare la rotella girevole per assicurarsi che la cuvetta entri in contatto con gli elettrodi di elettroporazione. Ora, esegui il programma di elettroporazione selezionato.
Durante l'elettroporazione, gli impulsi elettrici disturbano il doppio strato fosfolipidico degli esosomi sospesi nel tampone conduttivo. Ciò si traduce nella formazione di pori transitori nella membrana dell'esosoma, promuovendo la diffusione del siRNA nella vescicola. Il tampone aiuta a prevenire l'aggregazione di siRNA.
Una volta completata l'elettroporazione, i pori si richiudono, intrappolando il siRNA all'interno. Infine, rimuovere la cuvetta dall'elettroporatore e trasferire il composto in un tubo nuovo. Conservare gli esosomi incapsulati con siRNA a basse temperature fino a nuovo utilizzo.
Prima di iniziare l'elettroporazione, pre-raffreddare la cuvetta di elettroporazione con ghiaccio per 30 minuti. Mescolare 7 microgrammi di esosomi con 0,33 microgrammi di siRNA nella provetta da microcentrifuga. Aggiungere un tampone di acido citrico per ottenere il volume di 150 microlitri. Aggiungere la miscela esosoma-siRNA alla cuvetta di elettroporazione utilizzando una pipetta di plastica e tappare la cuvetta.
Posizionare la cuvetta con l'orientamento corretto nel supporto della cuvetta dell'elettroporatore e ruotare la rotella di rotazione dell'elettroporatore di 180 gradi in senso orario. Selezionare il programma desiderato e premere il pulsante Start per avviare l'elettroporazione. Il display indicherà un impulso riuscito.
Quindi, ruotare la ruota indietro di 180 gradi in senso antiorario e rimuovere la cuvetta. Utilizzare una pipetta di plastica per rimuovere il campione dalla cuvetta in una nuova provetta per microcentrifuga. Conservare il tubo sul ghiaccio o in frigorifero prima di un'ulteriore lavorazione se non viene utilizzato immediatamente.