Isolamento di cellule renali mure: una tecnica per isolare e generare colture primarie di cellule epiteliali tubulari renali

0 visualizzazioni3:21 min • April 30th, 2023

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Per isolare le cellule epiteliali tubulari renali o TEC, iniziare prendendo un rene di topo appena isolato in una capsula di Petri. Staccare la capsula renale - il sottile strato esterno che circonda il rene - e rimuovere il midollo o la parte più interna del rene, lasciando la corteccia contenente il tubulo e le cellule epiteliali tubulari.

Tritare le parti renali rimanenti in piccoli pezzi e incubarli in un tampone di digestione caldo contenente l'enzima collagenasi. La collagenasi scompone la proteina del collagene che tiene insieme i tessuti renali, rilasciando i tubuli renali e le cellule renali in sospensione.

Filtrare la sospensione per rimuovere i tessuti renali non digeriti. Quindi, aggiungere al filtrato terreni di coltura pre-refrigerati. La temperatura più bassa neutralizza la collagenasi e blocca l'ulteriore digestione dei tessuti. Centrifugare il filtrato a bassa velocità per consentire ai tubuli più densi e alle cellule tubulari di depositarsi mentre altri tipi di cellule e impurità rimangono sospesi.

Rimuovere questa frazione surnatante indesiderata e aggiungere terreni di coltura per risospendere il pellet. Seminare la sospensione in un piatto di coltura rivestito di collagene e incubare. Le cellule tubulari libere si attaccano saldamente al collagene mentre i tubuli rimangono sospesi. Sub-coltura per rimuovere i tubuli non attaccati e ottenere la coltura primaria di cellule epiteliali tubulari.

Per elaborare i reni raccolti, per prima cosa rimuovere le capsule renali e il midollo. Quindi, tritare entrambi i reni in piccoli pezzi e incubarli in 10 millilitri di tampone digestivo in un forno a 37 gradi Celsius con una leggera rotazione per 5 minuti.

Dopo la digestione, rimuovere eventuali tessuti non digeriti facendo passare il tampone attraverso un filtro da 70 micron. Dopo aver raccolto il tessuto digerito, aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura per fermare la digestione. Quindi, centrifugare la sospensione di tessuto filtrato a 50 x g per 5 minuti per pellettare le cellule tubulari. Quindi, trasferire il surnatante in una nuova provetta, aggiungere 5 millilitri di terreno di coltura e ripetere la centrifugazione per raccogliere le cellule tubulari rimanenti.

Ora, risospendere il primo pellet in 20 millilitri di terreno di coltura e centrifugarlo a 50 x g per 5 minuti per purificare ulteriormente le cellule raccolte. Smaltire il surnatante. Quindi, risospendere entrambi i pellet in 10 millilitri di terreno di coltura. Quindi, conta le cellule viventi usando la colorazione con blu di tripano. Quindi, semina fino a 10 milioni di cellule su un piatto rivestito di collagene da 60 millimetri e lascia che le cellule tubolari si attacchino durante la notte.

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Ultimo aggiornamento: 1 agosto 2026