Analisi dell'espressione proteica basata su array di proteine a fase inversa: una procedura per la quantificazione simultanea dell'espressione di più proteine dal lisato cellulare

Un campione tumorale contiene una popolazione eterogenea di proteine. Utilizzando il lisato tumorale, più di queste proteine possono essere analizzate in parallelo per identificare la proteina di interesse. Questa tecnica ad alto rendimento è chiamata Reverse Phase Protein Arrays o RPPA.

Per eseguire l'RPPA, iniziare prelevando un vetrino per immunodosaggio rivestito di nitrocellulosa. Individua una serie di proteine del lisato tumorale sul vetrino. Incubare per consentire la cattura delle proteine sulla nitrocellulosa. Successivamente, trattare il vetrino con un tampone bloccante che blocca i siti di legame degli anticorpi non specifici sulle proteine.

Rimuovere la soluzione bloccante in eccesso. A questo punto, montare il vetrino rivestito di proteine in un supporto e sigillarlo saldamente. Questo crea pozzetti temporanei sulla superficie dello scivolo. Quindi, caricare i pozzetti con una soluzione di anticorpi primari. Questi anticorpi riconoscono gli epitopi presenti sul bersaglio corrispondente da una miscela di proteine sull'array.

Infine, aggiungere gli anticorpi secondari marcati con fluorescenza. Questi anticorpi si legano agli anticorpi primari pre-legati, formando un com