Analisi dell'espressione proteica basata su array di proteine a fase inversa: una procedura per la quantificazione simultanea dell'espressione di più proteine dal lisato cellulare

Un campione tumorale contiene una popolazione eterogenea di proteine. Utilizzando il lisato tumorale, più di queste proteine possono essere analizzate in parallelo per identificare la proteina di interesse. Questa tecnica ad alto rendimento è chiamata Reverse Phase Protein Arrays o RPPA.

Per eseguire l'RPPA, iniziare prelevando un vetrino per immunodosaggio rivestito di nitrocellulosa. Individua una serie di proteine del lisato tumorale sul vetrino. Incubare per consentire la cattura delle proteine sulla nitrocellulosa. Successivamente, trattare il vetrino con un tampone bloccante che blocca i siti di legame degli anticorpi non specifici sulle proteine.

Rimuovere la soluzione bloccante in eccesso. A questo punto, montare il vetrino rivestito di proteine in un supporto e sigillarlo saldamente. Questo crea pozzetti temporanei sulla superficie dello scivolo. Quindi, caricare i pozzetti con una soluzione di anticorpi primari. Questi anticorpi riconoscono gli epitopi presenti sul bersaglio corrispondente da una miscela di proteine sull'array.

Infine, aggiungere gli anticorpi secondari marcati con fluorescenza. Questi anticorpi si legano agli anticorpi primari pre-legati, formando un complesso. Lavare il vetrino per rimuovere eventuali anticorpi secondari non legati. Sganciare la slitta dal supporto e lasciarla asciugare all'aria.

Scansiona il vetrino utilizzando uno scanner fluorescente. Le proteine bersaglio marcate con anticorpi emettono fluorescenza a una lunghezza d'onda specifica e appaiono come macchie colorate sulla superficie del vetrino.

Prima della stampa RPPA, da ciascun campione viene effettuata una serie di cinque diluizioni doppie. Uno degli aspetti più dispendiosi in termini di tempo di questa procedura è l'esecuzione di centinaia di diluizioni. Il successo può essere assicurato ricontrollando due volte prima di stampare i vetrini.

Uno spotter robotico MicroGrid II viene quindi utilizzato per individuare i lisati proteici su vetrini rivestiti di nitrocellulosa. Ogni campione viene individuato in triplicato, per un totale di 15 punti per campione. I vetrini utilizzati in questo esperimento contengono due cuscinetti su cui vengono individuati i campioni. Ogni pad è stato individuato con campioni identici, in questo caso 100 campioni. Altri formati disponibili includono 1, 8 e 16 diapositive per pad. Maggiore è il numero di tamponi, minore è il numero di campioni che possono essere individuati su ciascuno.

Per iniziare la procedura di rilevamento delle proteine, bagnare i vetrini in eccesso nel tampone bloccante e incubare a temperatura ambiente per 1 ora su una piattaforma a dondolo. Preparare 800 microlitri di anticorpi primari in tampone bloccante alle concentrazioni desiderate e conservare in ghiaccio. Dopo l'incubazione di un'ora nel tampone di bloccaggio, montare i vetrini nella Chip Clip a telaio singolo o nel supporto per vetrini a quattro alloggiamenti FastFrame in modo da formare una tenuta ermetica tra il vetrino e la camera di incubazione.

Rimuovere il tampone residuo dai pozzetti e aggiungere 600 microlitri di anticorpi primari ai rispettivi pozzetti. Posizionare i vetrini e la camera in una scatola umida sigillata e incubare su una piattaforma oscillante per una notte a 4 gradi Celsius. La mattina seguente, rimuovere i vetrini dalla cella frigorifera. Rimuovere con cautela gli anticorpi primari da ciascun pozzetto. Aggiungere 600 microlitri di PBS-Tween20 o PBS-T allo 0,1% e lavare i vetrini su una piattaforma oscillante a temperatura ambiente per 5 minuti.

Sostituire il PBS-T con un nuovo PBS-T. In questo modo, lava le diapositive per un totale di tre volte. Rimuovere il tampone dai pozzetti e aggiungere 600 microlitri di anticorpi secondari marcati in fluorescenza alla diluizione appropriata ai rispettivi pozzetti. Incubare con anticorpi secondari a temperatura ambiente per 45 minuti agitando delicatamente. È importante proteggere la membrana dalla luce fino al momento della scansione. Dopo 45 minuti, rimuovere gli anticorpi secondari dai pozzetti e lavare brevemente tre volte in 600 microlitri di PBS-T a temperatura ambiente.

Rimuovere i vetrini dal supporto, trasferirli in un contenitore adatto e lavare in eccesso il PBS-T per 15 minuti, mantenendo la membrana al buio. Rimuovere il PBS-T e lavare la membrana con PBS a temperatura ambiente per 15 minuti per rimuovere il residuo di Tween20, mantenendo nuovamente la membrana al buio. Asciugare i Fastslides in forno a 50 gradi Celsius per 10 minuti. Infine, scansionare i vetrini a 680 nanometri e/o 800 nanometri, a seconda degli anticorpi secondari utilizzati.