Aspirazione di liquidi da glomeruli di topo: un metodo per aspirare il liquido glomerulare dal topo utilizzando la micropuntura mediata da due fotoni

Nel rene, il glomerulo - un fascio di piccoli vasi sanguigni racchiusi nella capsula di Bowman - avvia la filtrazione del sangue ed espelle il fluido di scarto nello spazio circostante di Bowman. L'indagine sul contenuto del liquido glomerulare aiuta a comprendere la fisiologia renale.

Per aspirare il liquido glomerulare, preparare un topo anestetizzato con il rene esteriorizzato chirurgicamente. Ora, iniettare il colorante fluorescente destrano nei vasi sanguigni dietro l'orbita dell'occhio del topo. Le molecole di destrano fluorescente si muovono attraverso il flusso sanguigno e raggiungono il rene.

A causa dell'alto peso molecolare del destrano, il colorante fluorescente viene trattenuto all'interno del glomerulo, conferendogli un colore verde. Sotto un microscopio a due fotoni, che consente la visualizzazione di strutture profondamente posizionate, individuare un glomerulo adatto per ottenere un accesso adeguato al fluido glomerulare.

Quindi, allineare una punta per micropipetta rivestita di nanoparticelle fluorescenti rosse con l'asse laterale del rene. Utilizzando un micromanipolatore, far avanzare la punta della pipetta per penetrare nel rene. Quando la punta raggiunge il glomerulo bersaglio, impostare la velocità di aspirazione desiderata per aspirare il fluido glomerulare dallo spazio del Bowman.

L'assenza di fluorescenza verde all'interno del puntale rosso della pipetta indica l'assenza di sanguinamento e conferma il successo dell'aspirazione del liquido glomerulare. Successivamente, ritrarre la pipetta e conservare il fluido in un tampone appropriato per ulteriori analisi.

Dopo aver confermato la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita, applicare un unguento sugli occhi e utilizzare del nastro adesivo per immobilizzare le estremità di un topo adulto da 20 a 25 grammi. Usa una crema depilatoria per rimuovere tutti i peli sul lato sinistro dell'animale e usa la milza per localizzare il rene sinistro attraverso la pelle sul lato dorsale e caudale della milza.

Fai un'incisione di 0,5 centimetri nella pelle, seguita da un'incisione più piccola nel peritoneo, abbastanza grande da consentire al rene di essere spinto. Estrudere il rene con una leggera pressione e posizionare una forma stabilizzante renale in polisilossano attorno al tessuto. Allineare il rene con il distanziatore in modo tale che la superficie più laterale del rene si estenda oltre lo stabilizzatore di circa 1 millimetro e fissare il rene alla forma con adesivo cianoacrilato. Incollare una piastra di testa alla forma dello stabilizzatore e montare la piastra di testa sulle barre di montaggio sulla piastra di base.

Quindi, riempire il pozzetto nel supporto polisilossano con una soluzione di agarosio all'1% e tenere un vetrino coprioggetti da 10 millimetri sopra la forma fino a quando l'agarosio non è sodo. Sigillare il vetrino coprioggetti alla piastra di testa con la colla e creare un anello attorno al vetrino coprioggetti con cemento dentale. Quindi, iniettare da 100 a 150 microlitri di FITC-destrano per via retroorbitale e spostare rapidamente il mouse e la piastra di fissaggio sul tavolino del microscopio a due fotoni.

Dopo aver messo a fuoco manualmente la superficie renale, passare alla modalità a due fotoni senza scansione ed esplorare la finestra di imaging per individuare un glomerulo bersaglio che si trova a più di 30 micrometri sotto il vetrino coprioggetti e a meno di 400 micrometri dalla capsula renale laterale. Registra la distanza laterale e verticale dal glomerulo bersaglio. Quindi, registra le coordinate degli stadi x, y e z per il glomerulo e, infine, solleva il punto focale dell'obiettivo di circa 1 millimetro nella colonna d'acqua senza modificare le coordinate degli stadi x e y.

Inserire il puntale della pipetta nella colonna d'acqua e attivare l'eccitazione DAPI. Spostare la pipetta nelle dimensioni X e Y fino al punto di massima fluorescenza del puntale. Questo sarà il centro dell'obiettivo. Modificare l'impostazione di eccitazione in proteina fluorescente rossa e visualizzare la pipetta con l'oculare per consentire un centraggio preciso nella vista oculare.

Torna a due fotoni per trovare la pipetta sotto la vista a due fotoni in tempo reale e posiziona la punta esattamente al centro dell'immagine. Questa è la posizione di registrazione. Quindi, salvare un'immagine della pipetta e registrare il tavolino e le coordinate del controller della micropipetta. Rimuovere la pipetta dalla colonna d'acqua sull'asse x senza spostare gli assi y e z e spostare la pipetta Z sulla coordinata Z del glomerulo target e sul bordo del rene.

Annotare la fase X e calcolare la pipetta X sul bordo del rene utilizzando l'offset dalla fase di registrazione, X. Aumentare la fase X per spostare la fase verso la pipetta fino a quando il bordo del rene non si trova all'estrema sinistra dello schermo pur rimanendo visibile. Far avanzare rapidamente la pipetta a circa 100 micrometri di distanza dalla pipetta X del bordo del rene, come appena calcolato. Aumentare il guadagno di rosso e iniziare a far avanzare lentamente la punta della pipetta fino al bordo del rene con l'imaging a due fotoni in tempo reale mentre si monitora l'istogramma dei pixel rossi.

Guidare lentamente la pipetta sull'asse x fino alla pipetta X target del glomerulo, tenendo d'occhio lo stadio X. Una volta raggiunto il glomerulo, documenta la posizione con una pila Z. Con la pipetta in posizione, impostare la micropompa in modo che inietti 100 nanolitri di perfluorodecalina in 2 minuti per garantire la pervietà della pipetta e ridurre la confusione dovuta all'ostruzione della pipetta durante l'ingresso. Dopo 4-6 minuti di filtrazione, impostare la micropompa per aspirare fino a 300 nanolitri a una velocità massima di 50 nanolitri al minuto.