Name: Isolamento di cellule cardiache funzionali immunitario (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Impara a isolare cellule immunitarie cardiache funzionali dal ratto usando HBSS per lavaggi pericardici. Questo metodo evita l'attivazione enzimatica e preserva la reattività cellulare per analisi successive.

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Questo lavoro è stato supportato da una UNCF-Merck tesi di laurea Science Research Fellowship (JLM), National Heart, Lung, and Blood Institute concede RO1-HL-62228 (JSJ) e RO1-HL-073990 (JSJ).

1. Preparazione della soluzione Balance Hanks 'Salt (HBSS) <ol><li> Autoclave 1 bicchiere di vetro L, 1000 mL cilindro graduato, e mescolare bar. </li><li> Ricostituire la soluzione polvere HBSS in autoclave L 1 bicchiere di vetro per il marchio di 900 ml con acqua bidistillata. </li><li> Mescolare soluzione HBSS con 3,4 g di sale Hepes Na + e regolare il pH a un valore compreso tra 7,35-7,41 utilizzando concentrato HCL o NaOH. </li><li> Una volta che il pH desiderato è stato raggiunto e rimane stabile, aggiungere 5 g di BSA per la soluzione a temperatura ambiente fino a quando la albumina è completamente sciolto. </li><li> Aggiungere 10 ml di acqua antibiotico, antimyotic, alla soluzione e bidistillata fino a quando il volume totale è di 1000 ml marchio. </li><li> Mescolare bene la soluzione. </li><li> Filtrare la soluzione HBSS e separare in tubi Falcon da 50 ml per un uso successivo. Tubi aggiuntivi possono essere congelati e utilizzati in un secondo momento. </li></ol> 2. Animal PREPARAZIOn - Inserimento del tubo tracheale <ol><li> Preparare un vassoio con strumenti e materiali necessari per l'inserimento di un tubo tracheale (ad esempio pinze, forbici, tubo tracheale, 3-0 sutura nera intrecciata, ventilatore per piccoli animali, ecc.) </li><li> Una volta che il ratto è completamente anestetizzato con un cocktail di ketamina / xylazina nel rapporto di 2 a 1 xylazina ketamina, radere l'addome, torace e gola del ratto. Per garantire che un profondo stato anestetico è stato raggiunto, pizzicare piedi del ratto e controllare per il ritiro pedale dell'arto. Assicurarsi che il ratto è profondamente anestetizzati prima di fare tutte le incisioni. </li><li> Posizionare il topo con la testa sollevata su un tagliere che è inclinato di 30 ° di inclinazione </li><li> Eseguire un'incisione cutanea a partire dalla metà dell'addome al di sotto della mandibola. Sezionare via i muscoli del triangolo anteriore del collo per esporre la trachea. </li><li> Posizionare un 3-0 sutura nero intrecciato con la trachea. </li><li> Fare un'incisione nella trachea tra gli anelli cartilaginei unod inserire il tubo tracheale. Legare saldamente la sutura per fissare il tubo tracheale per la trachea. </li><li> Collegare il tubo tracheale di un ventilatore piccolo animale. </li></ol> 3. Preparazione dello strumento per l'isolamento delle cellule immunitarie <ol><li> Preparare un vassoio con gli strumenti per la procedura di isolamento delle cellule immunitarie (ad esempio pinze, forbici, HBSS, tagliato morbido teflon 24 gauge Baxter intravascolare sopra l'ago rapido cath) </li><li> Preparare due siringhe 10cc, riempire una siringa con HBSS per introdurre il buffer nel sacco pericardico e prenotare l'altro per l'aspirazione delle celle contenenti HBSS. 3.2.1. Ridurre la punta in Teflon del calibro 24 Baxter intravascolare nel corso del rapido-cath ago (1,6 cm) da 1 / 2 a 3 / 4 della sua lunghezza originale per la procedura di isolamento. </li><li> Mettere tutte le siringhe, tamponi, e un vuoto da 15 ml tubo Falcon (per tenere il liquido estratto, una volta procedura è terminata) su ghiaccio. </li></ol> &lt;p class = "jove_title"&gt; 4. Cella di isolamento immunitario <ol><li> Fai una incisione sulla linea mediana della parete addominale (lungo la linea alba) fino a raggiungere il processo xifoideo. </li><li> Partendo un po 'lateralmente al processo xifoideo, fare incisioni bilaterali attraverso la gabbia toracica continua con un angolo verso l'ascella. Fare attenzione a non forare i polmoni, il cuore o pericardio. </li><li> Una volta che le incisioni su entrambi i lati dello sterno sono completi, sezionare via la membrana dal costole inferiori, il taglio laterale a mediale. Nota: Siate sempre consapevoli di dove il pericardio si collega al diaframma e lo sterno per evitare danni. Utilizzare il legamento falciforme come punto di riferimento per notare dove il pericardio è attaccato sul lato opposto della membrana. Inoltre, se il pericardio è tagliato, la capacità di isolare le cellule si perde. </li><li> Sollevare delicatamente un lato della gabbia toracica per esporre la cavità toracica e il cuore (ancora incapsulato dal pericardio).</li><li> Prendere la siringa riempita HBSS e trovare un punto nel sacco pericardico circa a metà strada tra lo sterno e il cuore (preferibilmente più rostrale rispetto caudale) e inserire la punta del Teflon accorciato rapido cath attraverso entrambi gli strati del pericardio. </li><li> Una volta che il catetere è a posto, procedere con delicatezza riempire lo spazio pericardico con 2 o 3 ml di tampone HBBS. Saprete immediatamente se il catetere è posizionato correttamente quando si nota lo spazio pericardico espansione. Se nessun riempimento è testimoniata, prelevare e riposizionare il rapido-cath. </li><li> Quando il sacco pericardico è pieno, prendere l'altra siringa da 10 cc e posizionare la punta indietro nel pericardio e iniziare aspirare il tampone. Il foro di entrata lo stesso può essere usato o un altro possono essere creati. Assicurarsi che la punta non arrivare troppo a ridosso delle mura del sacco pericardico, fornendo aspirazione, soprattutto sul lato inferiore del cuore. Ciò potrebbe portare a pungere il pericardio e la perdita di cellule contenenti cellules. </li><li> Mentre aspirare il tampone, la punta del catetere può essere spostato all'interno del sacco pericardico al fine di raccogliere tampone quanto più possibile. </li></ol> Nota: se nel farlo leggermente strappare il pericardio e fare il buco nella parte superiore del cuore più grande del foro originale, non fatevi prendere dal panico. Finché il pericardio circonda ancora abbastanza del cuore è ancora possibile eseguire un'altra lavata sopra il cuore anche se con una minore quantità di tampone. Per la raccolta di una quantità ottimale di cellule, 3-4 lavaggi sono necessari ulteriori. <ol start="9"><li> Posizionare il tampone estratto nei tubi Falcon che sono stati immessi sul ghiaccio. </li><li> Rimuovere cuore, polmoni, e / o qualsiasi altro tessuto, se necessario, per ulteriori studi. Dopo la raccolta delle cellule immunitarie e di altri tessuti, il topo deve essere rapidamente e umanamente eutanasia. </li><li> Centrifugare i campioni raccolti cellule immunitarie per 10 min a 200 gr a 4 ° C. Tenere sempre i tubi in ghiaccioquando non in uso. </li><li> Rimuovere il surnatante e ricostituire il pellet in 1 ml di tampone Hyclone o HBSS. </li></ol> Nota: è importante contare il numero di cellule immunitarie ottenute da ogni cuore dopo la procedura di isolamento delle cellule immunitarie. 5. Rappresentante dei risultati: Un esempio di isolato mastociti cardiaci ottenuti con questa tecnica e colorati con blu di toluidina e safranina O / alcian blu sono presentati nelle figure 2A e 2B, rispettivamente. Come si può vedere in figura 3, L'albero cardiaco, hanno mantenuto la loro capacità di rilascio di istamina dopo il trattamento con attivatori noto come 48/80 composto e sostanza P, come descritto nella Morgan et al. 9 appezzamenti Rappresentante dispersione di citometria a flusso delle cellule CD4 + e cellule CD8 + sono presentati nelle figure 4 e 5, rispettivamente. I linfociti T sono ulteriormente identificati e fenotipizzati come una popolazione di cellule da questa tecnica. Figura 1. Diagramma di flusso della procedura di isolamento delle cellule cardiache immunitario. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig2.jpg"> . Immagini rappresentative Figura 2 istologica dei mastociti cardiaci sono macchiati come segue: (A) con blu di toluidina e (B) sono safranina O / Alcian blu. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig3.jpg"> Figura 3. Studio funzionale dei mastociti cardiaci isolati dalla regione epicardico miocardico e stimolati con 48/80 composto (10μg/mL) e sostanza P (10μM). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig4.jpg"> Figura 4. Rappresentante trame citometria a flusso dispersione dei CD4 + isolate cellule marcate con sostanza P (1:100 dilutione). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig5.jpg"> Figura 5. Citometria a flusso rappresentante di isolate cellule CD8 + etichettati con Sostanza P (diluizione 1:100).

<ol><li>Brower, G. L., Chancey, A. L., Thanigaraj, S., Matsubara, B. B., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cause+and+effect+relationship+between+myocardial+mast+cell+number+and+matrix+metalloproteinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cause and effect relationship between myocardial mast cell number and matrix metalloproteinase activity.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 283, H518-H525 (2002).</li>
<li>Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+inhibition+of+mast+cell+degranulation+prevents+left+ventricular+remodeling+induced+by+chronic+volume+overload+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiac+Failure%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic inhibition of mast cell degranulation prevents left ventricular remodeling induced by chronic volume overload in rats.</a> Journal of Cardiac Failure. 11, 548-556 (2005).</li>
<li>Chancey, A. L., Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mast+cell-mediated+activation+of+gelatinase+and+alteration+of+ventricular+diastolic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac mast cell-mediated activation of gelatinase and alteration of ventricular diastolic function.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 282, H2152-H2158 (2002).</li>
<li>Levick, S. P., Gardner, J. D., Holland, M., Hauer-Jensen, M., Janicki, J. S., Brower, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+from+adverse+myocardial+remodeling+secondary+to+chronic+volume+overload+in+mast+cell+deficient+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Protection from adverse myocardial remodeling secondary to chronic volume overload in mast cell deficient rats.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43, 56-61 (2008).</li>
<li>Levick, S. P., McLarty, J. L., Murray, D. B., Freeman, R. M., Carver, W. E., Brower, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Mast+Cells+Mediate+Left+Ventricular+Fibrosis+in+the+Hypertensive+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Cardiac Mast Cells Mediate Left Ventricular Fibrosis in the Hypertensive Rat.</a> Hypertension. 53, 1041-1047 (2009).</li>
<li>Batista, M. L., Santos, R. V., Cunha, L. M., Mattos, K., Oliveira, E. M., Seelander, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+pro-inflammatory+cytokine+production+and+peritoneal+macrophage+function+in+rats+with+chronic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Changes in the pro-inflammatory cytokine production and peritoneal macrophage function in rats with chronic heart failure.</a> Cytokine. 34, 284-290 (2006).</li>
<li>Galli, S. J., Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+Cells%3A+Versatile+regulator+of+inflammation%2C+tissue+remodeling%2C+host+defense+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dermatological+Science%22%5BJournal%5D)">Mast Cells: Versatile regulator of inflammation, tissue remodeling, host defense and homeostasis.</a> Journal of Dermatological Science. 49, 7-19 (2008).</li>
<li>Yndestad, A., Holm, A. M., Muller, F., Simonsen, S., Froland, S. S., Gullested, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+expression+of+inflammatory+cytokines+and+activation+markers+in+T-cells+from+patients+with+chronic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced expression of inflammatory cytokines and activation markers in T-cells from patients with chronic heart failure.</a> Cardiovasc. Res. 60, 141-146 (2003).</li>
<li>Bozkurt, B., Kribbs, S. B., Clubb, F. J., Michael, L. H., Didenko, V. V., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiologically+Relevant+Concentrations+of+Tumor+Necrosis+Factor-%C9%91+Promote+Progressive+Left+Ventricular+Dysfunction+and+Remodeling+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pathophysiologically Relevant Concentrations of Tumor Necrosis Factor-ɑ Promote Progressive Left Ventricular Dysfunction and Remodeling in Rats.</a> Circulation. 97, 1382-1391 (1998).</li>
<li>Frangogiannis, N. G., Lindsey, M. L., Michael, L. H., Youker, K. A., Bressler, R. B., Mendoza, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+Cardiac+Mast+Cells+Degranulate+and+Release+Preformed+TNF-%C9%91%2C+Initiating+the+Cytokine+Cascade+in+Experimental+Canine+Myocardial+Ischemia%2FReperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Resident Cardiac Mast Cells Degranulate and Release Preformed TNF-ɑ, Initiating the Cytokine Cascade in Experimental Canine Myocardial Ischemia/Reperfusion.</a> Circulation. 98, 699-710 (1998).</li>
<li>Jobe, L. J., Melendez, G. C., Levick, S. P., Du, Y., Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-%CE%B1+inhibition+attenuates+adverse+myocardial+remodeling+in+a+rat+model+of+volume+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">TNF-α inhibition attenuates adverse myocardial remodeling in a rat model of volume overload.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1462-H1468 (2009).</li>
<li>Forman, M. F., Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+histamine+secretion+during+isolation+of+rat+cardiac+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Spontaneous histamine secretion during isolation of rat cardiac mast cells.</a> Inflammation Research. 53, 453-457 (2004).</li>
<li>Levick, S. P., Murray, D. B., Janicki, J. S., Brower, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sympathetic+nervous+system+modulation+of+inflammation+and+remodeling+in+the+hypertensive+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Sympathetic nervous system modulation of inflammation and remodeling in the hypertensive heart.</a> Hypertension. 55, 270-276 (2010).</li>
<li>Morgan, L., Levick, S., Voloshenyuk, T., Murray, D., Forman, M., Brower, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+isolating+functional+mast+cells+from+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">A novel technique for isolating functional mast cells from the heart.</a> Inflammation Research. 57, 241-246 (2008).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Questo metodo di isolare le cellule immunitarie cardiaca permette l&#39;analisi della loro funzione, fenotipo, e la maturità senza l&#39;attivazione indesiderata che si verifica in genere nel corso di una tecnica tradizionale isolamento digestione enzimatica. Il numero medio totale di cellule ottenute con questa tecnica è di circa 400.000 per il cuore di ratto, e colorazione differenziale e l&#39;analisi di citometria a flusso di queste cellule indica popolazione mista di linfociti T (~ 70%), i macrofagi (~ 12%) e masto...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente e </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt &#39; </td><td> Sigma </td><td> H4891 </td><td> Una bottiglia fa 1 L di Salt Balance Hanks &#39; Soluzione. Equilibrio ricostituire Hanks &#39;Salt Soluzione come parte della procedura. </td></tr><tr><td> Antibiotico-Antimyotic </td><td> Gibco </td><td> 15240-062 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3784 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td> Sigma </td><td> A3912 </td><td></td></tr><tr><td> Flacone da 250 ml Nalogene Filtro </td><td> Thermoscientific </td><td> 157-0020 </td><td></td></tr><tr><td> 12 N HCL </td><td> Fisher Scientific </td><td> CAS 7647-01-0 </td><td> Per 6 N, aggiungere volumi uguali di HCL al deionizzataacqua. </td></tr><tr><td> 10 N NaOH </td><td> Fisher Scientific </td><td> SC267 </td><td> Per 5 N, aggiungere volumi uguali di NaOH in acqua deionizzata. </td></tr><tr><td> Doppia acqua distillata </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabella di attrezzature specifiche: <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente e </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> 3-O sutura in seta intrecciata </td><td> Ethicon Products </td><td> SA64H </td><td></td></tr><tr><td> Ventilatore piccoli animali </td><td> CWE Incorporated </td><td> SAR-830 </td><td> Impostare la velocità di respirazione a 40,5 respiri al minuto. </td></tr><tr><td> Smusso 18 gauge </td><td> BD Biosciences </td><td> 305199 </td><td> Trim aghi di 1 / 2 a 3 / 4 della sua lunghezza originale per l&#39;uso come un tubo tracheale. </td></tr><tr><td> Teflon Tip (con ago rimosso) di 24-gauge Baxter rapido cath catetere </td><td> Baxter </td><td> 2N111 </td><td> Ridurre la lunghezza punta in Teflon da 1 / 2 a 3 / 4. </td></tr><tr><td> 10 cc siringa </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-823-16B </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Falcon Tubi </td><td> BD Biosciences </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall RT6000B centrifuga refrigerata </td><td> Fisher Scientific </td><td> 75-004-377 </td><td> Ricordarsi di pre-raffreddare e conservare a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Hyclone </td><td> Thermoscientific </td><td> S300030.02 </td><td></td></tr><tr><td> Emocitometro </td><td> Hausser scientifico </td><td> HS-LB-1483 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento di cellule cardiache funzionali immunitario

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiaco cellule immunitarie stanno guadagnando interesse per i ruoli che svolgono nella rimodellamento patologico in molte malattie cardiache 1-5 Queste cellule del sistema immunitario, che includono i mastociti, le cellule T ei macrofagi;. Immagazzinare e rilasciare una varietà di mediatori biologici attivi tra cui citochine e proteasi, quali triptasi. 6-8 Questi mediatori hanno dimostrato di essere giocatori chiave nel metabolismo della matrice extracellulare, attivando metalloproteinasi della matrice o causare accumulo di collagene modulando il fibroblasti cardiaci &#39;funzione. 9-11 Tuttavia, le tecniche disponibili per isolare le cellule immunitarie hanno cardiaca stato problematico perché usano collagenasi batterica per digerire il tessuto miocardico. Questa tecnica causa attivazione delle cellule immunitarie e di conseguenza una perdita di funzione. Per esempio, i mastociti cardiaci diventano significativamente meno sensibili ai composti che causano la degranulazione. 12 Perciò, abbiamo sviluppato una tecnica che permette di tche l&#39;isolamento di cellule cardiache funzionali del sistema immunitario che porterebbe ad una migliore comprensione del ruolo di queste cellule nelle malattie cardiache. 13, 14 Questo metodo richiede una certa familiarità con la posizione anatomica del ratto processo xifoideo, ascella e legamento falciforme, pericardio e del cuore. Questi punti di riferimento sono importanti per aumentare il successo della procedura e per garantire una maggiore resa di cellule immunitarie cardiaco. Queste isolato cellule cardiache immunitarie possono quindi essere utilizzati per la caratterizzazione di funzionalità, fenotipo, la maturità e co-coltura con altri esperimenti cellule cardiache per ottenere una migliore comprensione delle loro interazioni.

Questo metodo per isolare le cellule immunitarie funzionale dal cuore offre un&#39;alternativa ai metodi convenzionali di digestione collagenasi, che provoca indesiderati attivazione immunitaria delle cellule, con conseguente diminuzione di risposta di queste cellule. Il nostro metodo di isolamento rese funzionali cellule cardiache immunitario evitando problemi legati alla digestione enzimatica.

Isolamento di cellule cardiache funzionali immunitario

Le cellule immunitarie cardiache stanno suscitando un crescente interesse per i ruoli che svolgono nel rimodellamento patologico di molte malattie cardiache.1-5 Queste cellule immunitarie, che ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cellule immunitarie cardiache funzionali. Questo viene ottenuto innanzitutto ventilando il ratto ed esponendo la sacca pericardica che circonda il cuore. Successivamente, una soluzione salina equilibrata di Hank o HBSS viene iniettata nello spazio pericardico.Quindi l'HBSS viene aspirato, il quale ora contiene cellule immunitarie provenienti dallo spazio pericardico. Infine, viene quantificato il numero di cellule immunitarie ottenute dalla procedura di isolamento. In ultima analisi, possono essere eseguiti esperimenti di degranulazione chimica o di co-coltura, analisi mediante citometria a flusso, analisi immunofluorescente o trattamenti farmacologici delle cellule per valutare la funzionalità e l'attività biologica delle cellule immunitarie cardiache.Ci saranno tre persone del mio laboratorio che mostreranno questa procedura: Jennifer McLarty, una studentessa laureata, Giselle Melendez, una ricercatrice post-dottorato, e il mio tecnico capo Spencer. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti di isolamento delle cellule immunitarie, ad esempio la digestione con collaghenasi, è che impedisce l'attivazione indesiderata e il danno alle cellule immunitarie, preservando al contempo la loro risposta ai trattamenti sperimentali. Prima di iniziare, posizionare una tavola da taglio inclinata a un angolo di 30 gradi.Quindi utilizzare un utensile elettrico Dremmel per tagliare da metà a tre quarti dell'estremità di un ago smussato del diametro di 18 gauge. Creare una punta più corta da usare come tubo endotracheale una volta che il ratto è stato monitorato. Per garantire un'adeguata anestesia, rasare l'addome, il torace e la gola dell'animale, quindi praticare un'incisione cutanea dall'addome medio fino al di sotto del mento.Successivamente, dissezionare i muscoli del triangolo anteriore del collo per esporre la trachea; una volta esposta, posizionare un filo di sutura nero intrecciato di calibro 3-0 al di sotto di essa. Effettuare ora un'incisione nella trachea tra gli anelli cartilaginei e inserire il tubo tracheale. Fissare saldamente il filo di sutura 3-0 intorno alla trachea per assicurare il tubo tracheale.Successivamente, collegare il tubo endotracheale a un ventilatore per piccoli animali e indurre la respirazione. Per garantire un'adeguata ossigenazione del cuore e dei polmoni, verificare un pari sollevamento e abbassamento del torace nel ratto durante rispettivamente l'inspirazione e l'espirazione del ventilatore. Prima di iniziare l'isolamento delle cellule immunitarie, riempire una siringa da 10 cc con HBSS.Quindi tagliare da metà a tre quarti dell'estremità del suggerimento morbido in Teflon di un catetere intravascolare Baxter da 24 gauge con ago guida. Accorciare rapidamente il suggerimento per l'isolamento. Posizionare il catetere intravascolare Baxter da 24 gauge con ago guida.Suggerimento rapido: mettere in ghiaccio il catetere collegato alla siringa contenente l'HBSS. Quindi posizionare la siringa riempita con HBSS, tutti i tamponi e una provetta conica da 50 millilitri vuota sul ghiaccio. Eseguire ora un'incisione mediana nella parete addominale, dalla linea alba fino al processo xifoidale.Quindi, partendo appena lateralmente al processo xifoidi, effettuare incisioni bilaterali attraverso la gabbia toracica. Proseguire con un angolo verso l'ascella, avendo cura di non lacerare i polmoni, il cuore o il pericardio. Successivamente dissezionare il diaframma dai margini inferiori delle costole, tagliando da laterale a mediale.Successivamente, utilizzare il legamento falciforme come punto di riferimento per individuare il punto in cui il pericardio è attaccato sul lato opposto del diaframma. Sollevare delicatamente un lato della gabbia toracica per esporre la cavità toracica e il cuore. Eseguire la puntura pericardica, aspirando l'HBSS e le cellule, quindi reinserire.Le siringhe sono le parti più difficili della procedura. Se si lacera leggermente il pericardio, non siate in panico. Finché il pericardio avvolge una porzione sufficiente del cuore da formare una sorta di coppa intorno ad esso, è comunque possibile effettuare i lavaggi sul cuore.Scegliere un punto sul pericardio approssimativamente a metà strada tra lo sterno e il cuore, preferibilmente più rostrale che caudale, e inserire la punta in teflon del catetere rapido attraverso entrambi gli strati del pericardio. Una volta posizionata la punta, riempire delicatamente lo spazio pericardico con due o tre millilitri di HBSS. Dopo aver riempito la sacca, passare la punta alla siringa vuota da 10 cc e reinserirla nello spazio pericardico.Utilizzando lo stesso foro di ingresso, aspirare la maggior quantità possibile di tampone, assicurandosi che la punta non si avvicini troppo alle pareti del sacco pericardico durante l'aspirazione, in particolare sulla faccia inferiore del cuore. Successivamente, trasferire il tampone nel tubo da 15 millilitri al momento dell'estrazione del liquido. Mantenendo il tubo a quattro gradi Celsius, riempire e svuotare il sacco pericardico con altri due-tre millilitri di HBSS.Trasferire circa altre tre o quattro volte l'HBSS recuperato nel tubo da 15 millilitri. Dopo ogni lavaggio, rimuovere quindi il cuore, i polmoni e/o qualsiasi altro tessuto necessario per altri studi. Mantenere i tubi sul ghiaccio.Quando non utilizzati, centrifugare i campioni di cellule immunitarie raccolti per 10 minuti a 200 volte la forza di gravità. A quattro gradi SIUs, rimuovere il soprannatante e quindi ricostituire il pellet in un millilitro di HBSS indicato.Di seguito sono riportati esempi di studi istologici per determinare la morfologia e la maturità cellulare dopo l'isolamento di cellule immunitarie cardiache. I mastociti cardiaci colorati con blu di toina e con blu AUM e con orecceina O sono mostrati rispettivamente a sinistra e a destra. Qui vengono presentati i risultati di uno studio funzionale in cui i mastociti cardiaci isolati dalla regione epicardica del cuore sono stati stimolati con attivatori noti.I mastociti cardiaci isolati mantengono la capacità di rilasciare istamina dopo il trattamento con 10 microgrammi per millilitro del composto 48 80 o con 10 micromoli di sostanza P. Nelle prossime due figure, vengono mostrati grafici a dispersione rappresentativi di un'analisi citometrica in flusso di cellule immunitarie cardiache isolate: nel primo grafico a dispersione sono state identificate cellule T positive per CD4 nell'isolato pericardico. Nel secondo grafico a dispersione sono state rilevate cellule T positive per CD8. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di proteggere l'integrità del pericardio durante l'iniezione della soluzione tampone e durante l'aspirazione della soluzione tampone contenente le cellule immunitarie, poiché ciò aumenterà il rendimento cellulare ottenuto.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Singoli cardiomiociti di topi wild type e mutanti possono essere isolati dal cuore per studiare la loro contrattilità e i transitori del calcio. Ciò consente di caratterizzare il contributo della disfunzione cellulare alla disfunzione cardiaca da qualsiasi causa.

Isolamento e fisiologica Analisi di mouse Cardiomyocytes

Le attuali conoscenze sulla base cellulare di malattie cardiache si basa principalmente su studi su modelli animali. Qui descriviamo e validare un nuovo metodo per ottenere singoli cardiomiociti vitali da piccoli campioni chirurgici di miocardio ventricolare umana. Miociti ventricolari umani possono essere utilizzati per studi elettrofisiologici e test della droga.

Isolamento e caratterizzazione funzionale di Human ventricolare Cardiomyocytes da campioni freschi chirurgici

tessuto cardiaco umano alberga popolazioni di cellule precursore perivascolari multipotenti che possono essere adatti per la rigenerazione del miocardio. La tecnica qui descritta permette l'isolamento e la purificazione simultanea di due popolazioni di cellule stromali multipotenti associati con i vasi sanguigni nativi, cioè CD146 + CD34 - periciti e CD34 + CD146 - cellule avventiziale, dal miocardio umano.

Isolamento di perivascolare Multipotent precursori delle cellule popolazioni dal cardiache umane Tissue

Questo protocollo presenta un metodo semplice ed efficace per isolare, identificare e quantificare le cellule immuni che risiedono nel miocardio dei topi durante stato stazionario o l'infiammazione. Il protocollo combina digestione enzimatica e meccanica per la generazione di una sospensione di singola cellula che può essere ulteriormente analizzata tramite flusso cytometry.

Isolamento e identificazione di cellule immunitarie extravascolare del cuore

L'obiettivo generale di questo articolo è quello di standardizzare il protocollo per l'isolamento, caratterizzazione e differenziamento di cellule staminali cardiache (CSCs) dal cuore di topo adulto. Qui, descriviamo un metodo di centrifugazione su gradiente di densità per isolare murino CSCs e metodi elaborati per la cultura, la proliferazione e la differenziazione in cardiomiociti di CSC.

Isolamento, caratterizzazione e differenziamento di cellule staminali cardiache dal cuore di topo adulto

Abbiamo ottimizzato un protocollo per isolare e purificare i periciti cardiaci murini per la ricerca di base e lo studio del loro potenziale di biologia e terapia.

Isolamento e purificazione dei Periciti Cardiaci Murine

Presentato qui è un protocollo per isolare vari sottoinsiemi di macrofagi e altre cellule non immuni dal miocardio umano e topidano preparando una sospensione a singola cellula attraverso la digestione enzimatica. Vengono inoltre presentati schemi di Gating per l'identificazione e la caratterizzazione basata sulla citometria del flusso di macrofagi.

Isolamento di sottoinsiemi di macrofaschi e cellule stromali da esemplari di miocardio umano e topo

L'obiettivo di questo lavoro è quello di sviluppare un metodo per isolare in modo riproducibile i cardiomiociti dal cuore adulto e misurare il contenuto di DNA e la nucleazione.

Isolamento dei cardiomiociti da cuori fissi per l'immunocitochimica e l'analisi dello ploidy

Un metodo è descritto per l'isolamento simultaneo di miociti e non miociti sia dagli atri che dai ventricoli di un singolo cuore adulto di topo. Questo protocollo si traduce in rese costanti di miociti cardiaci altamente vitali e non miociti e descrive in dettaglio le condizioni ottimali di coltura specifica delle cellule per la fenotipizzazione e l'analisi in vitro.

Isolamento simultaneo e cultura di miociti atriali, miociti ventricolari e non miociti da un cuore di topo adulto

Il protocollo qui presentato fornisce un approccio passo-passo per l'isolamento dei macrofagi residenti cardiaci dalla regione del nodo senoatriale (SAN) e del nodo atrioventricolare (AVN) dei cuori di topo.

Isolamento e coltura di macrofagi cardiaci residenti dal nodo senoatriale e atrioventricolare murino

Qui riportiamo un protocollo per la quantificazione e la differenziazione dei linfociti B miocardici in base alla loro posizione nello spazio intravascolare o endoteliale utilizzando la citometria a flusso.

Quantificazione e analisi basate sulla citometria a flusso delle cellule B miocardiche

Impara a isolare cellule immunitarie cardiache funzionali dal ratto usando HBSS per lavaggi pericardici. Questo metodo evita l'attivazione enzimatica e preserva la reattività cellulare per analisi successive.

Isolamento di cellule cardiache funzionali immunitario

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