Studiare età-dipendente instabilità genomica utilizzando il S. Saccharomyces Modello Durata cronologica

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare l'instabilità genomica dipendente dall'età nel lievito combinando la durata della vita cronologica con un insieme di semplici saggi di danno al DNA e di mutazione. Questo viene realizzato prelevando innanzitutto campioni di colture in invecchiamento cronologico ogni due giorni e verificando la vitalità mediante la formazione di unità formanti colonie o CFU. Il passo successivo della procedura consiste nell'esaminare le mutazioni del DNA prelevando campioni di colture in invecchiamento e seminando le cellule su un mezzo di selezione specifico per mutazioni.

Infine, è possibile ottenere risultati che mostrano i cambiamenti nelle mutazioni del DNA durante l'invecchiamento cronologico del lievito, normalizzando i risultati del saggio di mutazione rispetto alla vitalità. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'invecchiamento, come i meccanismi che collegano l'invecchiamento e l'instabilità genomica in aria. Per eseguire il saggio della durata della vita cronologica del lievito, o CLS, inoculare innanzitutto una singola colonia di lievito in un millilitro di mezzo sintetico completo con glucosio, o mezzo SDC, e incubare per tutta la notte con agitazione a 30 gradi Celsius. Il giorno successivo, diluire la coltura notturna in 10 millilitri di mezzo SDC fresco fino a un OD 600 compreso tra 0,05 e 0,1 ed incubare con agitazione a 30 gradi Celsius per tre giorni.

Al terzo giorno, quando le cellule sono in fase stazionaria, diluire ogni Eloqua 10.000 volte in acqua autoclavata, quindi prelevare due aliquote di 10 microlitri dal flacone e seminare 10 microlitri di ciascuna coltura diluita su una piastra A-Y-E-P-D. Incubare la piastra a 30 gradi Celsius fino alla comparsa delle colonie. Il numero di colonie formatesi, o unità formanti colonie, ottenuto dalla coltura del terzo giorno è considerato come 100% di sopravvivenza.

Continuare a prelevare aliquote dalla coltura in invecchiamento nei giorni successivi per la semina. Regolare i fattori di diluizione in modo appropriato per ottenere circa da 20 a 100 colonie nel saggio di UFC. Il campionamento viene interrotto quando la vitalità della coltura è diminuita sotto l'1%, tipicamente tra il giorno 11 e il giorno 13; la vitalità cellulare può inoltre essere studiata in cellule invecchiate su piastre.

Per iniziare questo saggio, inoculare una singola colonia in un millilitro di mezzo sintetico completo con glucosio e incubare per tutta la notte in agitazione a 30 gradi Celsius. Quando la coltura ha raggiunto una densità di circa 10 alla ottava cellule per millilitro, diluire la coltura con acqua autoclavata a 100-200 cellule per 10 microlitri e a 1000 cellule per 10 microlitri. Per ciascun ceppo, preparare un insieme di otto a venti piastre SDC senza triptofano etichettate in base alla densità di semina.

Per garantire che possano essere contate da 10 a 100 colonie, in previsione della ridotta vitalità durante l'invecchiamento, piastrare due aliquote di 10-30 microlitri di coltura diluita su ciascuna piastra. Incubare il set di piastre a 30 gradi Celsius per tutta la durata dell'analisi della longevità; nel giorno del piastraggio e successivamente ogni due giorni, prelevare una piastra e aggiungere goccia a goccia 0,5 millilitri di triptofano per consentire la crescita delle cellule vitali. Incubare la piastra a 30 gradi Celsius per ulteriori 48-72 ore.

Dopo 48-72 ore, contare le UFC per valutare la vitalità nel giorno dell'aggiunta di triptofano, al fine di analizzare il danno al DNA e la frequenza di mutazione durante l'invecchiamento cronologico. Un certo numero di ceppi con caratteristiche particolari viene coltivato in parallelo al ceppo di tipo selvaggio per il saggio del tempo di vita della lievito.

La frequenza di mutazione spontanea può essere valutata misurando la frequenza di resistenza alla canavanina in una coltura in invecchiamento cronologico. Le mutazioni nel gene can1, che codifica per la permeasi plasmatica dell'arginina, rendono le cellule resistenti all'analogo dell'arginina L-canavanina; le cellule resistenti alla canavanina cresceranno su piastre di mezzo sintetico completo privo di arginina, supplementato con solfato di L-canavanina. La misurazione della frequenza di riattivazione trip positiva in una ceppa contenente una mutazione amber nel gene trip. Una sequenza di rivestimento consente la stima del tasso di sostituzione di basi durante l'invecchiamento cronologico del lievito trip.

Le cellule con riattivazione positiva cresceranno su piastre prive di triptofano. Il ceppo negativo per la lisi EH150 presenta una mutazione di slittamento del frame di lettura di +4 nel gene in questione, che determina l'auxotrofia per la lisina; tale difetto può essere revertito da piccole mutazioni di inserzione o delezione. I revertanti verranno selezionati su piastre prive di lisina per rilevare riarrangiamenti cromosomici di grande entità (gcr).

Viene utilizzato un ceppo mutante in cui HX T 13, localizzato a 7,5 chilobasi telomerico rispetto a can uno sul cromosoma cinque, è interrotto da una cassetta U tre. Mutazioni nei geni can uno e U tre rendono rispettivamente resistenti alle cellule a L-canavanina e all'acido 5-fluoroorotico. Poiché la frequenza di mutazioni puntiformi che si verificano in entrambi i geni è bassa, l'analisi della frequenza di resistenza sia alla L-canavanina che all'acido 5-fluoroorotico fornisce una stima della frequenza di ricombinazione con perdita di eterozigosi (gcr) per monitorare il livello di ricombinazione omologa e non omologa. Durante l'invecchiamento cronologico, si generano mutanti che portano o ripetizioni invertite omologhe al 100% o omologhe al 91%.

La ricombinazione tra i siti IRS nel locus his tre consente l'espressione della proteina his tre funzionale. Pertanto, le cellule in cui si è verificata la ricombinazione cresceranno su piastre prive di istidina e supplementate con galattosio. Al terzo giorno, quando le cellule sono in fase stazionaria, verrà prelevata una quantità appropriata di cellule da ogni coltura in invecchiamento.

Dato che la stessa procedura viene utilizzata per tutti i saggi, verrà processato un solo campione. Ai fini di questo video, pellettare le cellule centrifugando in una centrifuga da banco. Rimuovere il soprannatante e risospendere le cellule in un millilitro di acqua per autoclave pellet.

Di nuovo, rimuovere il sopranatante e risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri di acqua; piastrare le cellule sulle piastre appropriate per selezionare i ricombinanti desiderati. Incubare le piastre a 30 gradi Celsius; dopo tre o quattro giorni, contare le UFC, la cui frequenza di mutazione viene normalizzata rispetto al numero di cellule vitali. Questo grafico mostra risultati rappresentativi ottenuti da un saggio tipico di durata della vita cronologica, in cui la sopravvivenza cronologica di cellule di tipo selvaggio viene confrontata con quella dei mutanti S CH nine delta TOR one delta e RAs two delta.

In colture liquide, i mutanti privi di TOR uno s, CH nove o RAs due mostrano un'aspettativa di vita cronologica prolungata. Inoltre, le carenze di s CH nove e RAs due mostrano un effetto additivo sulla promozione della longevità e della sopravvivenza cronologica in presenza di diverse fonti di carbonio. L'uso del saggio di vitalità NC due è mostrato in questo prossimo grafico.

Al primo giorno, colture di tipo selvatico SDC sono state diluite e seminate su piastre SC triplo dropout senza fonte di carbonio. Le piastre SC triplo dropout integrate con glucosio, etanolo o glicerolo sono state incubate a 30 gradi Celsius ogni due giorni. Da ogni serie è stata prelevata una piastra e sono stati aggiunti i nutrienti appropriati per consentire la crescita e la formazione di colonie.

La frequenza delle mutazioni dipendente dall'età varia notevolmente a seconda del ceppo, dell'ambiente genetico, delle manipolazioni genetiche, della coltura, delle condizioni e dell'età. Questa tabella mostra i risultati tipici ottenuti in un ceppo di tipo selvatico. I risultati rappresentativi della sintesi translesione sono mostrati nella prossima immagine.

L'aumento della frequenza di mutazione dipendente dall'età potrebbe coinvolgere cambiamenti nella riparazione errata del DNA mediante l'uso di estratti nucleari e diversi modelli di DNA. Possiamo valutare la sintesi di traslazione o TLS nelle cellule invecchiate cronologicamente. Sono stati analizzati estratti nucleari da cellule di fase stazionaria di tre giorni, di tipo selvaggio e da cellule mutanti SCH nine delta.

I prodotti TLS con stampo non danneggiato sono indicati da linee continue e i prodotti TLS con stampo danneggiato sono indicati da linee tratteggiate. Non è stata osservata sintesi trans-lesione negli estratti nucleari provenienti dal longevo s CH nine delta; i primer liberi sono indicati dalla freccia vuota. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire l'analisi della durata della vita cronologica e dell'analisi delle mutazioni del DNA nel lievito.