Studiare età-dipendente instabilità genomica utilizzando il S. Saccharomyces Modello Durata cronologica

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare l'instabilità genomica dipendente dall'età nel lievito combinando la durata cronologica della vita con una serie di semplici saggi di danno al DNA e mutazione. Ciò si ottiene campionando prima le colture di invecchiamento cronologico ogni due giorni e verificando la vitalità per unità formante colonia o formazione di UFC. Il passo successivo della procedura consiste nell'esaminare le mutazioni del DNA campionando colture di invecchiamento e piastrando le cellule su un terreno di selezione specifico per mutazione.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano cambiamenti nelle mutazioni del DNA durante l'invecchiamento cronologico del lievito normalizzando i risultati del test di mutazione alla vitalità. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'invecchiamento, come i meccanismi che collegano l'invecchiamento e l'instabilità genomica in aria Per saggiare la durata cronologica del lievito o CLS, inoculare prima una singola colonia di lievito in un millilitro di glucosio completo sintetico, o terreno SDC, e incubare durante la notte con agitazione a 30 gradi Celsius il giorno successivo. Diluire la coltura notturna in 10 millilitri di terreno SDC fresco a un OD 600 di 0,05-0,1 incubare agitando a 30 gradi Celsius per tre giorni.

Il terzo giorno, quando le cellule sono in fase stazionaria, diluire ogni Eloqua 10.000 volte in acqua in autoclave, quindi rimuovere due aliquote da 10 microlitri dal pallone e preparare 10 microlitri di ciascuna coltura diluita su piastra A-Y-E-P-D. Incubare la piastra a 30 gradi Celsius fino alla comparsa di colonie. Il numero di colonie che nascono o che formano colonie dalla cultura del terzo giorno è considerato al 100% di sopravvivenza.

Continuare a rimuovere le aliquote dalla coltura di invecchiamento nei giorni successivi per la piastratura. Regolando di conseguenza i fattori di diluizione per garantire circa 20-100 colonie nel saggio UFC. Il campionamento viene interrotto quando la vitalità della coltura è scesa al di sotto dell'1%In genere tra l'11° e il 13° giorno, la vitalità cellulare può essere studiata anche nelle cellule invecchiate su piastre.

Per iniziare questo test, inoculare una singola colonia in un millilitro di terreno di glucosio sintetico completo e incubare per una notte agitando a 30 gradi Celsius. Quando la coltura è cresciuta fino a circa 10-8 cellule per millilitro, diluire la coltura con acqua dell'autoclave a 100-200 cellule per 10 microlitri e 1000 cellule per 10 microlitri. Per ogni ceppo, preparare un set da otto a 20 piastre SDC per dropout di triptofano etichettate in base alla densità di placcatura.

Per garantire che si possano contare da 10 a 100 colonie, in previsione di una diminuzione della vitalità durante l'invecchiamento, su piastra si contano due aliquote da 10 a 30 microlitri di coltura diluita su ciascuna piastra. Incubare la piastra impostata a 30 gradi Celsius per tutta la durata dell'analisi della durata del ciclo di vita il giorno della placcatura e successivamente ogni due giorni, rimuovere una piastra e aggiungere goccia a goccia 0,5 millilitri di triptofano per consentire la crescita delle cellule vitali. Incubare la piastra a 30 gradi Celsius per altre 48-72 ore.

Dopo 48-72 ore. Contare i CFU per la vitalità per il giorno dell'edizione del triptofano per analizzare quattro danni al DNA e la frequenza delle mutazioni durante l'invecchiamento cronologico. Un certo numero di strange con caratteristiche speciali vengono coltivate in parallelo con il ceppo wild type per il test CLS del lievito.

La frequenza delle mutazioni spontanee può essere valutata misurando la frequenza della resistenza alla vanning della canna in una coltura cronologicamente invecchiata. Le mutazioni nel gene can one che codifica per l'arginina permeasi plasmatica rendono le cellule resistenti all'analogo dell'arginina L Canavan Le cellule resistenti al Canavan cresceranno sul dropout dell'arginina Piastre medie complete sintetiche integrate con L Canavan solfato Misurazione della frequenza di reversione positiva del trip in un ceppo contenente una mutazione ambra nel trip. Una sequenza di rivestimento consente di stimare il tasso di sostituzione delle basi durante il percorso cronologico di invecchiamento del lievito.

Le cellule di reversione positiva cresceranno sulle placche di dropout del triptofano. Il ceppo di lisi negativo EH one 50 ospita uno spostamento più quattro nel frame di lettura aperto, che si traduce in atrofia del bue per la lisina, e questo può essere invertito da piccole mutazioni di inserzione o delezione. I revertanti saranno selezionati su piastre di dropout di lisina per rilevare riarrangiamenti cromosomici macroscopici o gcr.

Viene utilizzato un ceppo mutante in cui HX T 13 situato a 7,5 kilobasi telomerico a can one sul cromosoma cinque è interrotto da una U tre mutazioni a cassetta in entrambi i geni can one e U tre rendono le cellule resistenti rispettivamente a L Canavan e cinque acido fluoro orotico. Poiché la frequenza delle mutazioni puntiformi che si verificano in entrambi i geni è bassa, l'analisi della frequenza di resistenza sia all'acido El Canavan che a quello dell'acido fluoro orotico fornisce una stima del gcr per monitorare il livello di ricombinazione omologa e omologa. Durante l'invecchiamento cronologico vengono generati mutanti che portano ripetizioni invertite omologhe al 100% o omologhe al 91%.

La ricombinazione dell'IRS a tre locus tra l'IRS consente l'espressione delle sue tre proteine funzionali. Pertanto, le cellule in cui si è verificata la ricombinazione cresceranno su piastre di dropout dell'istidina integrate con galattosio. Il terzo giorno, quando le cellule sono in fase stazionaria e verrà rimossa una quantità appropriata di cellule da ogni coltura di invecchiamento.

Poiché la stessa procedura viene utilizzata per tutti i saggi, verrà elaborato un solo campione. Ai fini di questo video, pellettare le celle mediante centrifuga da banco. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in un millilitro di pellet d'acqua in autoclave.

Ancora una volta, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet di cella in 100 microlitri di celle della piastra d'acqua sulle piastre appropriate per selezionare i ripristini desiderati. Incubare le piastre a 30 gradi Celsius dopo tre o quattro giorni di conteggio delle CFU, la frequenza di mutazione viene normalizzata al numero di cellule vitali. Questo grafico mostra i risultati rappresentativi di un tipico saggio cronologico sulla durata della vita, quando la sopravvivenza cronologica delle cellule wildtype viene confrontata con quella di S, CH, nove delta, TOR un delta e RAs due mutanti delta.

Nelle colture liquide, i mutanti privi di TOR 1, CH nine o RA 2 mostrano una durata cronologica estesa. Inoltre, le carenze in s CH nove e RA due mostrano un effetto additivo sulla sopravvivenza cronologica della promozione della longevità in presenza di varie fonti di carbonio. L'utilizzo del saggio di vitalità NC two è mostrato in questo grafico successivo.

Il primo giorno, le colture di tipo selvatico SDC sono state diluite e piastrate su piastre di dropout SC trip senza fonte di carbonio. Le piastre di dropout SC Tripp integrate con glucosio, etanolo o glicerolo orato sono state incubate a 30 gradi Celsius ogni due giorni. Una piastra è stata recuperata da ogni set e sono stati aggiunti nutrienti appropriati per consentire la crescita e la formazione di colonie.

La frequenza delle mutazioni dipendenti dall'età varia notevolmente a seconda del ceppo, del background, della manipolazione genetica, della cultura, delle condizioni e dell'età. Questa tabella mostra i risultati tipici ottenuti in un ceppo wild type. I risultati rappresentativi della sintesi delle lesioni trans sono mostrati in questa immagine successiva.

L'aumento della frequenza delle mutazioni dipendenti dall'età può comportare cambiamenti nella riparazione errata del DNA utilizzando estratti nucleari e vari modelli di DNA. Possiamo valutare la sintesi di traduzione o TLS nelle cellule cronologicamente invecchiate. Sono stati analizzati estratti nucleari da cellule mutanti in fase stazionaria di tre giorni, wild type e SCH nine delta.

I prodotti TLS con dima non danneggiata sono indicati da linee continue e i prodotti TLS con dima danneggiata sono indicati da linee tratteggiate. Non è stata osservata alcuna sintesi di lesioni trans negli estratti nucleari dei primer liberi mutanti di lunga durata s CH nine sono indicati dalla freccia aperta. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'analisi cronologica della durata della vita e delle mutazioni del DNA nel lievito.