JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:16 min. • July 8th, 2025
I fosfolipidi sono lipidi complessi contenenti gruppi fosfato. Queste molecole sono idrolizzate da un enzima chiamato fosfolipasi.
Per eseguire il saggio di attività della fosfolipasi, prelevare un'emulsione di tuorlo d'uovo ricca di fosfolipidi, che fungono da substrato per l'enzima. Aggiungere il tuorlo a una soluzione calda di agarosio contenente cloruro di sodio, che migliora la stabilità delle proteine del tuorlo durante le fasi successive.
Integrare la miscela con cloruro di calcio e un colorante fluorescente: la rodamina. Versare il composto in una piastra di Petri. Dopo la solidificazione, i fosfolipidi del tuorlo rimangono distribuiti in modo omogeneo nella matrice di gel di agarosio.
Utilizzando un tubo, creare pozzetti adeguatamente distanziati nel gel. Aggiungere ai pozzetti concentrazioni variabili di estratto proteico grezzo contenente fosfolipasi. Incubare la piastra a temperatura fisiologica.
La fosfolipasi dell'estratto si diffonde radialmente nel gel. Gli ioni calcio nel gel si legano alla fosfolipasi, attivando gli enzimi. Questo enzima scinde i fosfolipidi, generando acidi grassi liberi. Le molecole di rodamina nel gel formano un complesso con gli acidi grassi rilasciati.
Dopo l'illuminazione con luce ultravioletta, osservare l'aspetto di aloni fluorescenti intorno ai pozzetti. L'alone conferma la presenza di attività enzimatica. Con concentrazioni più elevate di fosfolipasi, le molecole dell'enzima si diffondono ulteriormente, aumentando il diametro dell'alone.
Lavare un uovo di gallina con l'1% di SDS in acqua distillata e separare il tuorlo dall'albume in condizioni sterili.
Preparare le soluzioni A, B, C e D. Aggiungere 500 microlitri di soluzioni A e C alla soluzione B e 100 microlitri di soluzione D. Mescolarli e versare 25 millilitri in ciascuna capsula di Petri. Attendere che la soluzione si solidifichi in condizioni sterili e praticare pozzetti di circa 2 o 3 millimetri di diametro, con un tubo sottile.
Aggiungere un totale di 20 microlitri di tampone fosfato come controllo negativo in un pozzetto e 20 microlitri di una determinata fosfolipasi come controllo positivo in un altro pozzetto.
Mettere diverse quantità di proteina dell'estratto grezzo - 5, 15, 25, 35 e 45 microgrammi nei pozzetti rimanenti, ciascuno in un volume finale di 20 microlitri. Incubare a 37 gradi Celsius per 20 ore.