Saggio di chiralità cellulare con micropatterning a forma di anello: una tecnica in vitro per determinare la chiralità multicellulare basata sull'allineamento cellulare su micropattern a forma di anello

Per determinare la chiralità delle cellule di mammifero in vitro - la distorsione sinistra-destra delle cellule per allinearsi in un orientamento verso sinistra o verso destra in condizioni di confinamento - iniziare con vetrini rivestiti in oro fabbricati su misura in una piastra multipozzetto contenente terreno. I vetrini comprendono micropattern di isole a forma di anello di fibronectina che promuove l'adesione cellulare, riempite con un monostrato autoassemblato resistente all'adesione cellulare.

Successivamente, seminare un volume appropriato di sospensione di cellule di mammifero sui vetrini e incubare. Le cellule si adsorbono sui micropattern ad anello contenenti fibronectina. Il monostrato autoassemblato circostante impedisce l'adesione non specifica delle celle al di fuori dei confini dell'anello.

Sostituire il supporto, rimuovendo eventuali celle non attaccate, con un supporto nuovo. Aggiungere un farmaco che interferisce con l'actina a una serie di vetrini e incubare.

Le cellule aderenti proliferano, diffondendosi e assumendo la forma delle isole di fibronectina sottostanti, mentre riorganizzano le loro fibre di actina in risposta ai segnali spaziali, che confinano il monostrato cellulare, promuovendo l'allineamento distorto.

Ora, trattare i vetrini con paraformaldeide per la fissazione cellulare. Al microscopio a contrasto di fase, le cellule sui micropattern ad anello appaiono come regioni scure con contorni luminosi allineati secondo la loro distorsione preferenziale.

Utilizzando il software, calcola l'angolo di allineamento di ciascuna cella come la deviazione dalla direzione circonferenziale dell'anello. Media per determinare la chiralità delle cellule di mammifero. Le cellule trattate con farmaci che interferiscono con l'actina possono mostrare chiralità inversa.

Prima di seminare le cellule, scaldare il terreno e la tripsina a bagnomaria, temperato a 37 gradi Celsius.

Per un migliore fissaggio delle cellule, immergere il vetrino modellato in una piastra a 12 pozzetti contenente terreni di coltura e riscaldarlo a 37 gradi Celsius nell'incubatore. Una volta che le cellule sono tripsinizzate, neutralizzare le cellule con terreni contenenti FBS. Pellettare le celle a 100 x g per 3 minuti, quindi risospendere il pellet delle celle in un terreno fresco. Contare le cellule e diluire la sospensione cellulare per ottenere la concentrazione di 200.000 cellule per millilitro.

Aggiungere 0,5 millilitri della sospensione cellulare a ciascun pozzetto contenente un vetrino d'oro. Agitare delicatamente la piastra alcune volte per una semina uniforme delle cellule, prima di incubare per 15 minuti per l'attacco delle cellule. Dopo 15 minuti, controllare l'attacco della cellula al microscopio e, se necessario, incubare per un altro po' di tempo.

Una volta che le cellule sono attaccate, aspirare il terreno contenente le cellule non attaccate da ciascun pozzetto e aggiungere 1 millilitro di terreno di coltura fresco. Coltivare le cellule nell'incubatore per 24 ore e controllare la confluenza per determinare se si è formata la chiralità.

Una volta raggiunta la confluenza richiesta, fissare le cellule rimuovendo il terreno di coltura. Dopo aver risciacquato una volta con PBS, aggiungere una soluzione di paraformaldeide al 4% al vetrino e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti, prima di risciacquare nuovamente con PBS tre volte.

Per acquisire le immagini, utilizzare un microscopio a contrasto di fase con funzionalità fotocamera e acquisire ogni anello sul vetrino ad alta risoluzione.

Per la caratterizzazione della chiralità, scarica i file di codice MATLAB. Aggiungi la cartella del codice e le sottocartelle al percorso MATLAB e apri il file "ROI_selection.m". Alla riga 4, modificare la directory nella cartella dei dati desiderata.

Cambia la dimensione dell'immagine nella riga 14, con le prime due cifre che rappresentano la dimensione del cerchio interno dell'anello, mentre le altre due rappresentano l'esterno.

Per determinare la regione di interesse o il ROI nelle immagini a contrasto di fase, eseguire il codice MATLAB "ROI_selection.m" m facendo clic sul pulsante Esegui. Trascina manualmente il quadrato di selezione per adattarlo all'anello, quindi fai doppio clic sull'immagine per confermare la selezione.

Dopo aver selezionato la ROI da tutte le immagini nella cartella, verrà generato un file ".mat" per memorizzare le informazioni sulla ROI per ciascuna immagine. Quindi, apri il file "Analysis_batch.m" e modifica la directory della cartella come mostrato in precedenza. Fare clic sul pulsante Esegui per eseguire il codice "Analysis_batch.m" per determinare la chiralità di più modelli di anelli cellulari.

Verrà generato un file "datatoexcel.txt", contenente statistiche circolari per ogni anello, nonché il numero di anelli in senso orario, non chirale e antiorario.