JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:44 min • July 8th, 2025
All'interno dei mitocondri, la citrato sintasi, localizzata nella matrice della membrana mitocondriale interna, è l'enzima limitante che catalizza la reazione tra l'acetil coenzima A e l'acido ossalacetico per formare citrato, il primo passo del ciclo dell'acido citrico.
Per analizzare l'attività della citrato sintasi, trasferire i toraci adulti di mosca Drosophila abbondanti nei mitocondri in una provetta riempita con un tampone di estrazione refrigerato contenente acido etilendiamminotetraacetico, EDTA e un detergente non ionico.
Omogeneizzare i tessuti del torace sul ghiaccio per prevenire la denaturazione delle proteine mediata dal calore. La forza di taglio applicata, in combinazione con i detergenti, lisa il tessuto e rilascia componenti intracellulari, compresi i mitocondri.
Inoltre, la rottura della membrana mitocondriale interna porta al rilascio di proteine della matrice mitocondriale, tra cui la citrato sintasi. L'EDTA si lega ai cationi bivalenti e inibisce l'attività della proteasi, impedendo così la degradazione delle proteine.
Diluire l'omogenato utilizzando il tampone di estrazione e aggiungere un volume appropriato nella miscela di reazione contenente i pozzetti della piastra a più pozzetti. La miscela di reazione comprende acetil coenzima A, acido ossalacetico e acido ditionitrobenzoico.
La citrato sintasi nell'omogenato catalizza la reazione tra l'acido ossalacetico e l'acetil coenzima A, formando citrato e coenzima A con un gruppo tiolico. Il gruppo tiolico reagisce con l'acido ditionitrobenzoico incolore, formando un prodotto giallo, l'acido tionitrobenzoico.
Utilizzando un lettore di micropiastre, misurare l'assorbanza della soluzione di colore giallo. L'assorbanza potrebbe essere correlata all'attività della citrato sintasi nell'omogenato tissutale.
Trasferire immediatamente 10 toraci di mosca adulta in 100 microlitri di tampone di estrazione ghiacciato e omogeneizzarli con un pestello sul ghiaccio. Mantenere i campioni freddi omogeneizzandoli per cinque-10 secondi sul ghiaccio, lasciandoli riposare sul ghiaccio per cinque secondi, quindi ripetendo fino a quando tutti i tessuti non sono completamente omogeneizzati.
Aliquotare 10 microlitri di ciascun campione omogeneizzato in una nuova provetta per la misurazione del contenuto proteico, mantenendo anche queste provette in ghiaccio. Aggiungere 400 microlitri di tampone di estrazione a freddo ghiacciato a ciascun campione rimanente per un volume totale di 500 microlitri e pipettare delicatamente su e giù per mescolare.
Per ogni reazione, aggiungere 1 microlitro di lisato cellulare diluito a 150 microlitri della soluzione di reazione appena preparata. Miscelare accuratamente pipettando delicatamente, assicurandosi di evitare la formazione di bolle. Quindi, utilizzare un lettore di piastre per misurare l'assorbanza a 412 nanometri ogni 10-30 secondi per quattro minuti a 25 gradi Celsius.
Traccia i dati come assorbanza nel tempo, quindi calcola la pendenza per la parte lineare della curva. Infine, dividere la velocità di reazione o la pendenza per la concentrazione della proteina del campione per normalizzare l'attività della citrato sintasi.