Saggio dell'attività della citrato sintasi: un test colorimetrico per misurare l'attività della citrato sintasi mitocondriale nell'omogenato tissutale di Drosophila

All'interno dei mitocondri, la citrato sintasi, localizzata nella matrice della membrana mitocondriale interna, è l'enzima limitante che catalizza la reazione tra l'acetil coenzima A e l'acido ossalacetico per formare citrato, il primo passo del ciclo dell'acido citrico.

Per analizzare l'attività della citrato sintasi, trasferire i toraci adulti di mosca Drosophila abbondanti nei mitocondri in una provetta riempita con un tampone di estrazione refrigerato contenente acido etilendiamminotetraacetico, EDTA e un detergente non ionico.

Omogeneizzare i tessuti del torace sul ghiaccio per prevenire la denaturazione delle proteine mediata dal calore. La forza di taglio applicata, in combinazione con i detergenti, lisa il tessuto e rilascia componenti intracellulari, compresi i mitocondri.

Inoltre, la rottura della membrana mitocondriale interna porta al rilascio di proteine della matrice mitocondriale, tra cui la citrato sintasi. L'EDTA si lega ai cationi bivalenti e inibisce l'attività della proteasi, impedendo così la degradazione delle proteine.

Diluire l'omogenato utilizzando il tampone di estrazione e aggiungere un volume appropriato nella miscela di reazione contenente i pozzetti de