JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:03 min • July 8th, 2025
Nei tessuti, il ferro, un minerale essenziale cruciale per vari processi metabolici, esiste normalmente sequestrato alle emoproteine e alle proteine del ferro non eme. Le emoproteine includono ferro ferroso o eme legato agli anelli porfirinici, mentre le proteine del ferro non eme mancano della struttura dell'anello porfirinico e comprendono principalmente ferro ferrico o non eme.
Per stimare il contenuto di ferro non eme nel tessuto epatico di topo, trattare un frammento di tessuto epatico di topo essiccato e raccolto con basse concentrazioni di acido cloridrico e acido tricloroacetico. Incubare ad alte temperature per digerire il tessuto e facilitare la precipitazione proteica indotta dall'acido.
A causa delle basse concentrazioni di acido, il ferro non eme viene rilasciato dalle proteine associate. Il ferro eme, essendo legato all'anello porfirinico, rimane inalterato.
Dopo il raffreddamento, trasferire il volume desiderato di surnatante contenente ferro non eme in una piastra a più pozzetti. Aggiungere il ferro-chelante cromogenico, bofenantrolina sulfonato, BPS, addizionato con acido tioglicolico, un agente riducente, in un tampone adatto e incubare.
L'acido tioglicolico riduce tutto il ferro ferrico non eme in ferro ferroso, che può facilmente legarsi al BPS in un rapporto 1:3, formando un complesso altamente stabile di colore rosa. Inoltre, l'acido tioglicolico previene le interferenze dovute a cationi metallici bivalenti contaminanti come il rame che possono interagire con il BPS.
Posizionare la piastra multipozzetto in un lettore di micropiastre per misurare l'assorbanza dei complessi ferrosi-BPS rosa, rappresentativi della concentrazione di ferro non eme nel frammento di tessuto epatico di topo.
Trasferire ogni pezzo di tessuto essiccato in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere 1 millilitro della miscela acida al tubo e chiuderlo. Preparare un bianco acido allo stesso modo, tranne per il fatto che il tessuto viene omesso qui.
Incubare le provette a 65 gradi Celsius per 20 ore per digerire il tessuto.
Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, utilizzare una micropipetta dotata di puntali in plastica per trasferire 500 microlitri di estratto acido limpido in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Preparare le reazioni cromogene direttamente nelle micropiastre di polistirene a fondo piatto, a 96 pozzetti, trasparenti, non trattate. Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
Misura l'assorbanza del campione in un lettore di piastre a una lunghezza d'onda di 535 nanometri rispetto a un riferimento di acqua deionizzata.