Saggio pull-down a singola molecola per l'analisi della fosforilazione delle proteine: una tecnica ad alto rendimento per quantificare la fosforilazione delle proteine nel lisato cellulare

La fosforilazione di alcune proteine cellulari è importante per la loro funzione biologica.

Per quantificare i livelli di fosforilazione delle proteine intatte utilizzando un saggio pull-down a singola molecola, iniziare prelevando un vetrino coprioggetti con un pattern a griglia. Ogni scomparto è rivestito con polietilenglicole biotinilato o linker a base di PEG intervallati con PEG normale per prevenire l'impedimento sterico durante il legame proteico.

Trattare il vetrino coprioggetti con un reagente riducente per ridurre al minimo l'autofluorescenza durante l'analisi. Sovrapporre il vetrino coprioggetti con le Neutravidine - proteine leganti la biotina - e incubare, consentendo loro di legare i linker PEG biotinilati.

Integrare l'array con anticorpi proteici specifici anti-bersaglio. Ogni anticorpo contiene biotina legata alla sua regione Fc, che aiuta ad ancorare l'anticorpo alla neutravidina, causando l'immobilizzazione.

Ora, aggiungere il lisato di coltura cellulare contenente varie proteine, tra cui le varianti fosforilate e non fosforilate della proteina bersaglio con fluorescenza verde, e incubare. Entrambe le varianti della proteina bersaglio vengono catturate dagli anticorpi, formando complessi. Lavare per rimuovere le proteine non legate.

Successivamente, trattare questi complessi con la seconda serie di anticorpi rossi marcati con fluorescenza, che legano esclusivamente i residui fosforilati della proteina, impartendo un diverso segnale di fluorescenza al complesso.

Immagine dell'array al microscopio a fluorescenza e osservazione di due distinti segnali di fluorescenza. La colocalizzazione di entrambi i segnali di fluorescenza indica la presenza di proteine fosforilate nel campione.

Rimuovere gli array funzionalizzati di biotina-PEG dal congelatore e bilanciarli a temperatura ambiente. Posizionare il vetrino coprioggetti con l'array rivolto verso l'alto su una piastra di coltura tissutale da 100 millimetri rivestita con pellicola sigillante. Incubare ogni quadrato dell'array con 10 milligrammi per millilitro di boroidruro di sodio e PBS per 4 minuti a temperatura ambiente. Lavare tre volte con PBS.

Successivamente, incubare con 0,2 milligrammi per millilitro di NeutrAvidin in T50 per 5 minuti, quindi lavare tre volte con T50-BSA. Ripetere l'incubazione con 2 microgrammi per millilitro di anticorpo biotinilato specifico per POI in T50-BSA per 10 minuti, seguita da lavaggio.

Innanzitutto, scongelare e miscelare il lisato mediante pipettaggio. Diluire 1 microlitro di lisato in 100 microlitri di T50-BSA/PPI ghiacciato. Incubare il lisato sull'array per 10 minuti, seguito dal lavaggio. Preparare l'anticorpo anti-fosfotirosina coniugato AF647 in T50-BSA/PPI ghiacciato e incubare sull'array per 1 ora.

Deposita una goccia d'olio sull'obiettivo. Posiziona la nanogriglia sul tavolino per l'imaging. Utilizzando la luce bianca trasmessa, concentrarsi sul modello della griglia. Acquisisci una serie di 20 immagini della griglia. Assicurati che i pixel non siano saturi e salva la serie di immagini come "Fiducial".

Sfocare la nanogriglia per creare un motivo Airy. Acquisire una serie di 20 immagini per le calibrazioni del guadagno e salvare l'immagine come "Guadagno". Quindi, acquisire una serie di 20 immagini per l'offset della fotocamera bloccando tutta la luce alla fotocamera e salvare l'immagine come "Sfondo".

Per acquisire le immagini SiMPull, per prima cosa, pulisci l'obiettivo dell'olio e deposita altro olio sull'obiettivo. Fissare il vetrino coprioggetti sul tavolino del microscopio. Acquisisci immagini per ogni campione, prima nel canale rosso lontano, seguito da fluorofori a lunghezza d'onda inferiore. Controllare il livello del tampone ogni 30-45 minuti e rabboccare se necessario.