Saggio pull-down a singola molecola per l'analisi della fosforilazione delle proteine: una tecnica ad alto rendimento per quantificare la fosforilazione delle proteine nel lisato cellulare

La fosforilazione di alcune proteine cellulari è importante per la loro funzione biologica.

Per quantificare i livelli di fosforilazione delle proteine intatte utilizzando un saggio pull-down a singola molecola, iniziare prelevando un vetrino coprioggetti con un pattern a griglia. Ogni scomparto è rivestito con polietilenglicole biotinilato o linker a base di PEG intervallati con PEG normale per prevenire l'impedimento sterico durante il legame proteico.

Trattare il vetrino coprioggetti con un reagente riducente per ridurre al minimo l'autofluorescenza durante l'analisi. Sovrapporre il vetrino coprioggetti con le Neutravidine - proteine leganti la biotina - e incubare, consentendo loro di legare i linker PEG biotinilati.

Integrare l'array con anticorpi proteici specifici anti-bersaglio. Ogni anticorpo contiene biotina legata alla sua regione Fc, che aiuta ad ancorare l'anticorpo alla neutravidina, causando l'immobilizzazione.

Ora, aggiungere il lisato di coltura cellulare contenente varie proteine, tra cui le varianti fosforilate e non fosforilate della proteina bersaglio con fluorescenza verde, e incubare. Entrambe le varianti della proteina bersaglio vengono catturate dagli antic