Saggio di separazione di fase proteica: un metodo optogenetico per la separazione di fase proteica legante l'RNA mutante nei motoneuroni spinali di larve di zebrafish

Le proteine nucleari leganti l'RNA, RBP, sono proteine multifunzionali composte da regioni ordinate con struttura tridimensionale ben definita e regioni meno stabili e intrinsecamente disordinate, IDR.

In diverse malattie neurodegenerative, le mutazioni specifiche dell'IDR causano la localizzazione errata delle RBP nel citoplasma e si impegnano in modo aberrante in interazioni deboli, formando inclusioni dinamiche e prive di membrana, un fenomeno chiamato separazione di fase. Alla fine, queste inclusioni maturano in aggregati tossici e insolubili, con conseguente disfunzione neuronale e degenerazione.

Per studiare la separazione di fase RBP in vivo utilizzando l'optogenetica, iniziare con una larva di zebrafish transgenica anestetizzata e dechorionata, che esprime un RBP mutato IDR fuso con un reporter fluorescente e un dominio fotorecettore sensibile alla luce blu, in un tampone adatto.

Quindi, montare la larva lateralmente su una goccia di agarosio fuso per l'imaging del midollo spinale. Lasciare solidificare l'agarosio, immobilizzando la larva. Utilizzando un microscopio confocale, acquisire immagini del midollo spinale per visualizzare le RBP fluorescenti, localizzate all'inter