Saggio di germinazione di perline per la valutazione dell'angiogenesi in fase iniziale: un modello in vitro basato su perline per studiare la germinazione endoteliale in presenza di periciti

L'angiogenesi è la formazione di nuovi vasi sanguigni dai vasi sanguigni esistenti durante le condizioni di sviluppo e patologiche. Un'ampia comunicazione tra le cellule endoteliali che rivestono la superficie interna dei vasi sanguigni e i periciti circostanti - cellule di supporto sul lato esterno dei vasi sanguigni - è fondamentale per l'angiogenesi.

Per studiare l'angiogenesi in vitro, iniziare con cellule endoteliali e microsfere portanti rivestite di periciti sospese in una soluzione di fibrinogeno, una glicoproteina solubile che agisce come precursore della fibrina.

Ora, pipettare la sospensione di perle in una piastra di coltura contenente una soluzione di trombina, un enzima proteolitico, e incubare. La trombina si lega alla molecola di fibrinogeno, provocando la sua scissione per formare monomeri di fibrina insolubili, formando gel polimerico di fibrina. Questa fase garantisce l'inclusione di perle rivestite di cellule nel gel di fibrina.

Successivamente, piastra una coltura di fibroblasti - cellule precursori del tessuto connettivo - sopra il gel di fibrina e incuba per consentire l'attivazione dei fibroblasti.

Durante l'incubazione, i fibroblasti secernono fattori cruciali per la crescita angiogenica che innescano l'attivazione delle cellule endoteliali. In combinazione, i periciti aderenti e le cellule endoteliali secernono molecole di segnalazione che aiutano la germinazione delle cellule endoteliali nel gel di fibrina.

I germogli endoteliali appaiono come sporgenze cellulari allungate avvolte nei periciti, che rappresentano la fase iniziale dell'angiogenesi.

Esaminare le piastre delle perle rivestite di microcarrier al microscopio con un ingrandimento di 20 volte per confermare che tutte le perle siano state sufficientemente rivestite dalle cellule endoteliali.

Trasferire le piastre in una cappa a flusso laminare e utilizzare una pipetta P1000 per aspirare ed erogare energicamente le soluzioni di perline rivestite per staccare le cellule dal fondo della piastra e trasferire i surnatanti in provette individuali.

Lasciare che le perline si depositino sul fondo dei tubi per tre minuti. Quindi, utilizzare la pipetta P1000 per rimuovere la maggior parte possibile dei surnatanti senza disturbare i grappoli di perline. Risospendere le perle in un millilitro di terreno completo per provetta e lasciare che le perle si depositino per 30-60 secondi. Utilizzare la pipetta P1000 per aspirare nuovamente il surnatante e lavare le cellule endoteliali libere dalla sospensione del microsnodo con un terreno completo fresco, altre due volte, come appena dimostrato.

Dopo il terzo lavaggio, risospendere le perle in 2,5 millilitri di soluzione di fibrinogeno. Aggiungere 13 microlitri di soluzione di trombina per pozzetto, in una piastra di vetro a 24 pozzetti. Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di soluzione di perline/fibrinogeno a ciascun pozzetto, avendo cura di pipettare accuratamente le perle direttamente nella trombina, e pipettare lentamente su e giù due o tre volte per mescolare accuratamente le soluzioni.

Quando tutti i pozzetti sono stati seminati, lasciare che la soluzione di trombina-fibrinogeno si precoaguli nella cappa a flusso laminare per 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, trasferire con cura la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per altre 1,5-2 ore.

Quando il gel si è completamente solidificato, risospendere i normali fibroblasti polmonari umani a una concentrazione di 2 x 10⁴ cellule per millilitro in terreno completo e aggiungere un millilitro di fibroblasti a ciascun pozzetto. Quindi, rimettere la piastra nell'incubatore per colture cellulari.