JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:55 min. • July 8th, 2025
Per valutare il potenziale di un composto larvicida di prova, un antagonista del recettore della dopamina, utilizzando il saggio di contatto larvale, iniziare con larve di zanzara vive allo stadio di sviluppo o di stadio desiderato in mezzi acquosi. Trasferire un numero uguale di larve nei pozzetti di una piastra a più pozzetti.
Sostituire il terreno nei pozzetti con acqua deionizzata per evitare qualsiasi interferenza da parte di contaminanti che potrebbero avere un impatto negativo sulle larve. Aggiungere concentrazioni crescenti del composto in esame ai rispettivi pozzetti.
Agitare delicatamente la piastra per facilitare il contatto tra le larve e il composto in esame. Incubare la piastra in condizioni appropriate.
Al contatto con le larve, il composto in esame entra nella parete corporea o nello strato più esterno e raggiunge gli spiracoli, aperture del sistema tracheale, che sono collegati ai gangli - ammasso di cellule nervose - che costituiscono il sistema nervoso centrale.
Sulle cellule nervose, il composto in esame si lega ai siti di legame secondari dei recettori della dopamina, che sono coinvolti nei processi cellulari critici. Questo legame, anche con il neurotrasmettitore dopamina legato al recettore della dopamina, impedisce l'attivazione del recettore e la segnalazione a valle, interrompendo lo sviluppo larvale, causando infine la morte.
Registrare il numero di larve non responsive, prive di movimento, in ciascun pozzetto in un momento specifico dopo l'esposizione al composto in esame in concentrazioni variabili.
L'aumento del tasso di mortalità larvale con l'aumentare della concentrazione indica il potenziale larvicida del composto in esame.
Per iniziare, etichettare i pozzetti di una piastra di coltura tissutale trasparente a 24 pozzetti. Utilizzare una bilancia analitica per pesare il composto in esame. Quindi, sciogliere il composto in acqua sterile a doppia distillazione in un tubo da 1,5 millilitri, ottenendo una soluzione madre da 80 millimoli. Successivamente, diluire in serie la soluzione madre utilizzando acqua a doppia distillazione per preparare soluzioni stock di lavoro delle concentrazioni desiderate.
Si noti che occorre prestare attenzione quando le larve vengono aggiunte ai pozzi, durante la rimozione dell'acqua in eccesso e quando viene aggiunta la sostanza chimica in esame, per evitare danni fisici alle larve. Le lesioni possono aumentare la mortalità e, quindi, produrre risultati falsi positivi o invalidare il test.
Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica a foro largo per trasferire cinque larve di terzo stadio in ciascun pozzetto della piastra. Quindi, utilizzare una pipetta da 1 millilitro per rimuovere delicatamente l'acqua e sostituirla con il volume desiderato di acqua a doppia distillazione.
Fare attenzione a non toccare le larve quando si rimuove l'acqua. Lavorare rapidamente per assicurarsi che le larve non si secchino e aggiungere delicatamente la sostanza chimica di prova pipettandola contro il lato opposto del pozzetto di plastica.
Aggiungere un volume appropriato di soluzione di analisi a ciascun pozzetto e ruotare delicatamente la piastra per garantire una miscelazione uniforme. Posizionare la piastra in una camera di crescita, mantenendo un ciclo luce-buio di 12 ore a 25 gradi Celsius con un'umidità relativa compresa tra il 75% e l'85%.
Per controllare il movimento larvale, picchiettare delicatamente la piastra. Se non si osserva alcun movimento, toccare delicatamente la larva con uno stuzzicadenti sterile. Classificare la larva come morta se non si nota alcuna risposta e utilizzare un foglio di valutazione per registrare il numero totale di larve morte in ciascun pozzetto nei punti temporali descritti nel protocollo di testo.