Test topico: una tecnica per valutare il potenziale insetticida degli antagonisti del recettore della dopamina su zanzare femmine adulte mediante applicazione topica

Il test topico nelle zanzare dipende dalla deposizione diretta di un composto di prova attivo sul torace dorsale di zanzare adulte per testarne le proprietà insetticide.

Per iniziare, anestetizzare le zanzare femmine adulte esponendole al minimo termico critico: una bassa temperatura che interrompe la loro attività neuromuscolare.

Posizionare le singole zanzare femmine anestetizzate sotto un microscopio da dissezione. Prendi una siringa di vetro collegata a un micro-applicatore riempita con il composto in esame - un antagonista del recettore della dopamina - in un solvente non polare. Posizionare l'ago vicino al torace e utilizzare il micro-applicatore per depositare con cura una goccia del composto in esame sulla superficie dorsale.

Dopo l'applicazione, trasferire le zanzare trattate in una camera di crescita con condizioni ambientali controllate per un determinato periodo.

Il solvente non polare nella gocciolina solubilizza i lipidi nella cuticola - un rivestimento esterno - permettendo al composto di penetrare all'interno. Il composto si diffonde attraverso lo strato epidermico sottostante e raggiunge i gangli toracici, un denso gruppo di cellule nervose collegate al sistema nervoso.

Una volta raggiunte le cellule nervose, il composto si lega a un sito allosterico - un sito di legame aggiuntivo per le molecole regolatorie - sul recettore della dopamina. Il legame allosterico ostacola la cascata di segnalazione a valle dopo il legame con la dopamina - un neurotrasmettitore che controlla i processi biologici critici - che porta alla morte.

Dopo la durata dell'esperimento, registrare il numero di zanzare morte - individui trattati privi di qualsiasi movimento - per valutare il potenziale insetticida del composto in esame.

Coltiva zanzare femmine adulte di 3-5 giorni in una gabbia di plastica da 20 litri. Etichettare i bicchieri di carta da 9 once con il nome e la concentrazione del composto di prova.

Quindi, preparare una soluzione madre da 10 μg/μL del composto in esame in acetone in una fiala di vetro da 20 millilitri. Quindi, diluire in serie la soluzione madre per ottenere le concentrazioni di lavoro desiderate.

Pulire una siringa di vetro da 1 millilitro con acetone, quindi riempirla con la soluzione di test alla concentrazione appropriata. Fissare la siringa in un micro-applicatore, regolato per erogare un volume di 0,25 microlitri.

Quindi, usa un aspiratore per rimuovere dieci zanzare femmine adulte di 3-5 giorni dalla gabbia e anestetizzale per 5 minuti a 4 gradi Celsius. Quindi, trasferisci le zanzare in una capsula di Petri e metti la pirofila sul ghiaccio per 10 minuti.

Per evitare di danneggiare la zanzara adulta, che potrebbe contribuire alla mortalità, assicurarsi che non siano anestetizzate in frigorifero per più di 5 minuti, o immobilizzate sul ghiaccio per più di 10, e ridurre al minimo la manipolazione delle zanzare. Se si ha accesso a una piastra fredda e a un micromanipolatore con un tavolino mobile, ciò può ridurre ulteriormente la manipolazione delle zanzare.

Usa una pinzetta sottile per rimuovere ogni zanzara dal piatto. Con il micro-applicatore a siringa, applicare 0,25 microlitri di soluzione di prova sul torace dorsale al microscopio da dissezione. Quindi, trasferisci le zanzare in un bicchiere di carta etichettato con ghiaccio. Sigilla la coppetta con un quadrato a maglie di 10 x 10 centimetri e un elastico. Quindi, trasferiscilo nella camera di crescita e registra il numero di zanzare morte.