JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 4:38 min • July 8th, 2025
L'endotossina, una tossina batterica gram-negativa presente sulla membrana esterna, è un lipopolisaccaride, LPS, composto principalmente da lipidi e polisaccaridi, tra cui il lipide A e l'antigene O. Quando viene rilasciato durante l'infezione, viene riconosciuto dal sistema immunitario, innescando risposte infiammatorie basate sulle citochine.
Per stimare la contaminazione da endotossine in una nano-formulazione di farmaci liposomiali utilizzando il lisato di amebociti Limulus, LAL, preparare provette di reazione, una contenente il farmaco e l'altra contenente il farmaco addizionata con una concentrazione nota di endotossine.
Aggiungere il reagente LAL contenente lisato proteico ottenuto da granchio a ferro di cavallo, Limulus polyphemus, cellule del sangue o amebociti. Il lisato comprende serina proteasi inattive - fattore B, fattore C, enzima proclottante - e una proteina coagulante del gel, il coagulogeno.
Agitare i tubi e caricarli in un torbidimetro per misurare la torbidità delle soluzioni.
In presenza di LPS contaminante legato a farmaci liposomiali, il fattore C sensibile all'LPS viene attivato autocataliticamente, che quindi scinde e attiva il fattore B che converte l'enzima pro-coagulazione in enzima della coagulazione. Questo enzima attivato scinde i legami peptidici del coagulogeno, formando monomeri di coagulina.
Alla fine, i monomeri polimerizzano attraverso le interazioni tra le regioni idrofobiche esposte sulla testa di una persona e la coda idrofobica di un'altra, portando all'aggregazione e alla formazione di gel coagulinico torbido insolubile. La torbidità misurata aiuta a determinare la concentrazione di endotossine nella nanoformulazione.
Il recupero calcolato dei picchi dalle concentrazioni di endotossine nei campioni addizionati e di prova entro l'intervallo accettabile indica che non ci sono interferenze importanti dalla nanoformulazione, convalidando la presenza di endotossine nel farmaco nanoformulato.
Per la preparazione dello standard di calibrazione, utilizzare 900 microlitri di lisato di amebociti Limulus o acqua di grado LAL, e 100 microlitri di endotossina standard di controllo, per preparare tutte le diluizioni intermedie necessarie, per consentire la preparazione di uno standard di calibrazione con una concentrazione di un'unità di endotossina per millilitro.
Quindi, utilizzando 900 microlitri di acqua di grado LAL e 100 microlitri dello standard di calibrazione di un'unità di endotossine per millilitro, preparare un secondo standard di calibrazione a una concentrazione di 0,1 unità di endotossine per millilitro.
Quindi, ripetere la diluizione seriale di 10 volte per preparare due standard di calibrazione inferiori, per ottenere un totale di quattro standard di calibrazione che vanno da 0,001 a 1 unità di endotossina per millilitro.
Per preparare un controllo di qualità di 0,05 unità di endotossina per millilitro, combinare 50 microlitri di un'unità di endotossina per millilitro di soluzione di endotossina standard di controllo con 950 microlitri di acqua LAL.
Successivamente, nel software, selezionare le "Impostazioni strumento" e creare il modello. Seleziona "Raccogli dati" e inserisci l'ID del test e il gruppo di dati nella scheda "Generale". Nella scheda "Hardware", selezionare il tipo di strumento e il metodo LAL, quindi verificare che sullo schermo vengano visualizzati un numero di serie, l'ID del sistema e le informazioni sulla porta seriale.
Fare clic su "OK" due volte per confermare la selezione dello strumento e la comunicazione con lo strumento e inserire gli ID dei campioni nello stesso ordine in cui verranno testati i campioni. Quindi, utilizzare i pulsanti predefiniti per inserire il controllo negativo, la curva standard e i campioni di prova.
Aggiungere il volume appropriato di standard di calibrazione del controllo negativo e del controllo di qualità in provette di vetro pre-marcate duplicate e aggiungere il volume appropriato di LAL alla prima fiala di test. Agitare brevemente la fiala e posizionarla nelle apposite fessure di prova nel carosello dello strumento.
Prima di caricare i campioni, eseguire diverse diluizioni del nanomateriale di prova entro la diluizione massima valida come dimostrato.