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Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 2:57 min. • July 8th, 2025
La membrana esterna dei batteri Gram-negativi contiene endotossine chiamate lipopolisaccaridi, o LPS. L'LPS ha una porzione oligosaccaridica idrofila e una regione lipidica A idrofobica.
Una volta all'interno dell'ospite, le proteine che legano l'LPS riconoscono le endotossine. Queste proteine legano quindi i recettori sulle cellule immunitarie circolatorie. Questo legame attiva le cellule immunitarie, che rilasciano fattori infiammatori. La sovrapproduzione di questi fattori esagera la risposta immunitaria, causando la morte cellulare.
Per rilevare le endotossine utilizzando il lisato di amoebociti Limulus, o saggio LAL, assumere una formulazione contenente endotossine legate alla superficie lipofila delle nanoparticelle attraverso le loro porzioni lipidiche A idrofobiche.
Aggiungere il reagente LAL alla provetta. Questo reagente è un lisato acquoso contenente enzimi e proteine inattivi derivati dagli amebociti, le cellule del sangue del granchio a ferro di cavallo.
Incubare la provetta per facilitare il legame delle endotossine al proenzima fattore C della coagulazione inattivo derivato dal lisato, attivandolo autocataliticamente.
Il fattore C attivato scinde un altro proenzima, il fattore B, formando una proteasi che scinde un enzima pro-coagulazione e lo converte in una forma attiva - enzima coagulante limulus. Questo enzima scinde il coagulogeno, una proteina inattiva della coagulazione, nella coagulina.
I monomeri della coagulina si legano attraverso le loro code idrofobiche alle teste idrofobiche di altri monomeri della coagulina. Questa autopolimerizzazione provoca la formazione di un omopolimero che appare come un coagulo gelatinoso alla base del tubo. Capovolgere delicatamente il tubo.
Un coagulo solido che rimane sul fondo del tubo conferma la presenza di endotossine.
Per eseguire un gel-clot LAL, preparare l'endotossina standard di controllo a una concentrazione finale di 4 lambda e combinare 100 microlitri di standard con 100 microlitri di acqua, o campione di prova, per ottenere una concentrazione finale di endotossina 2 lambda standard di controllo.
Aggiungere 100 microlitri di lisato ad ogni diluizione lambda. Agitare brevemente i tubi e posizionare la rastrelliera di tubi in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 1 ora.
Al termine dell'incubazione, capovolgere le provette con un movimento regolare e registrare manualmente i risultati utilizzando il segno più per un coagulo solido e il segno meno per l'assenza di coaguli o un coagulo allentato.