$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Gli enzimi che degradano i carboidrati scompongono i polisaccaridi complessi in oligosaccaridi più piccoli.
Per eseguire lo screening dell'attività di degradazione enzimatica, iniziare assumendo più idrogel polimerici cromogenici, CPH, che vengono preparati tingendo i polisaccaridi con coloranti clorotriazinici di colore diverso. Ogni polisaccaride viene quindi reticolato chimicamente per formare idrogel, un substrato sintetico per la degradazione enzimatica.
Ora, erogare diversi substrati CPH in pozzetti distinti di una piastra di reazione porosa. Aggiungere una soluzione di attivazione e incubarla per garantire un'attivazione ottimale dei substrati.
Posizionare la piastra di analisi su una piastra di prodotto vuota. Centrifugare le piastre insieme a bassa velocità per facilitare una rimozione efficiente della soluzione di attivazione attraverso i pori della piastra di reazione.
Successivamente, integrare tutti i pozzetti della piastra di reazione con lo stesso tipo di enzima che degrada i carboidrati in un tampone appropriato che mantiene un pH ottimale per l'attività enzimatica. Sigillare la piastra e incubarla con una leggera agitazione per consentire una distribuzione uniforme degli enzimi nella rete polimerica, consentendo loro di accedere al substrato.
Durante l'incubazione, l'enzima, con un'attività appropriata contro il substrato, degrada i polisaccaridi in CPH per produrre oligosaccaridi più piccoli legati al colorante. Questi prodotti sono solubili, rendendo la soluzione colorata. Girare le piastre per raccogliere la soluzione colorata nella piastra del prodotto.
Spettrofotometricamente, determinare l'assorbanza del prodotto per misurare l'attività enzimatica.
Per iniziare, attivare la piastra del kit del saggio con filtro a 96 pozzetti aggiungendo 200 microlitri di soluzione di attivazione a ciascun pozzetto. Incubare a temperatura ambiente senza agitare per 10 minuti.
Utilizzare una centrifuga e qualsiasi piastra standard a 96 pozzetti per la raccolta per centrifugare la soluzione di attivazione esistente. Aggiungere 100 microlitri di acqua sterile al polimero cromogenico idrogel, o substrati CPH, e applicare un vuoto o una centrifuga per rimuovere lo stabilizzante. Ripetere il lavaggio altre due volte.
Per preparare la reazione enzimatica, aggiungere 150 microlitri di tampone acetato di sodio da 100 millimolari pH 4,5 e 5 microlitri di soluzione endocellulasica con tre diverse concentrazioni, a ciascun pozzetto della piastra del kit del saggio.
Posizionare la piastra del prodotto sotto la piastra del kit di analisi per raccogliere eventuali perdite dalla piastra di reazione durante l'agitazione. Quindi, incubare la piastra del kit del saggio a temperatura ambiente in un agitatore orizzontale a 100 giri/min per 30 minuti.
Per ricevere dati affidabili, è necessario agitare la miscela di reazione durante l'incubazione.
Posizionare la piastra del kit di analisi con la piastra del prodotto sottostante nella centrifuga e centrifugare a 2.700 x g per 10 minuti per trasferire il prodotto di reazione nei pozzetti della piastra del prodotto.
Dopo la centrifuga, ispezionare visivamente la piastra del prodotto per verificare che il volume di liquido in ciascun pozzetto sia approssimativamente lo stesso. Utilizzando un lettore di piastre, leggere l'assorbanza della piastra di raccolta a 630 nanometri per i diversi substrati CPH verdi.