JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:27 min. • July 8th, 2025
La biomassa è una materia organica di origine vegetale composta principalmente da polisaccaridi complessi. Gli enzimi che degradano i carboidrati agiscono su questi polisaccaridi per produrre oligosaccaridi più piccoli.
Per valutare l'attività di degradazione di un enzima, iniziare prendendo diversi substrati di biomassa cromogenica insolubile - ICB presenti nei pozzetti di una piastra di reazione porosa. Questi substrati sono ottenuti dalla tintura di materiali di origine vegetale con un colorante specifico di clorotriazina. La biomassa risultante ha polisaccaridi complessi marcati con coloranti che fungono da substrato per l'attività enzimatica.
Ora, aggiungi una soluzione tampone contenente l'enzima idrolizzante dei carboidrati. Il tampone mantiene il pH per un'attività enzimatica ottimale. Posizionare la piastra di reazione su uno shaker e incubare. L'agitazione costante consente alle molecole dell'enzima di raggiungere il polisaccaride bersaglio nel substrato ICB.
Durante l'incubazione, l'enzima idrolizzante scinde i legami glicosidici covalenti all'interno dei polisaccaridi a catena lunga. La reazione produce oligosaccaridi solubili legati a molecole di colorante, che rimangono nella soluzione.
Al termine della degradazione, posizionare la piastra di reazione sopra una piastra del prodotto e centrifugare l'assemblaggio. Durante la centrifugazione, la soluzione colorata contenente i prodotti di reazione, passa attraverso il filtro sul fondo della piastra e viene raccolta nella piastra del prodotto. Utilizzando un lettore di piastre, registrare l'assorbanza del surnatante.
Un valore di assorbanza più elevato denota la generazione di un gran numero di oligosaccaridi legati al colorante, indicando l'efficienza dell'enzima nella degradazione del substrato ICB.
Per eseguire il test cromogenico con biomassa cromogenica insolubile rossa, o ICB-paglia di grano, iniziare aggiungendo 200 microlitri di soluzione di attivazione a ciascun pozzetto della piastra di analisi. Quindi, incubare la piastra a temperatura ambiente, senza agitare per 10 minuti.
Rimuovere lo stabilizzatore utilizzando 100 microlitri di acqua sterile per lavare i pozzetti tre volte. Quindi, aggiungere 150 microlitri di tampone acetato di sodio da 100 millimolari, pH 4,5 e 5 microlitri da 10 unità per millilitro di diversa soluzione di endo-xilanasi.
Posizionare la piastra del prodotto sotto la piastra del substrato per raccogliere eventuali perdite dalla piastra del substrato durante l'agitazione e incubare la reazione a temperatura ambiente e 100 giri/min per 2 ore.
Dopo l'incubazione, posizionare la piastra del kit di analisi, con la piastra del prodotto sottostante, nella centrifuga e centrifugare a 2.700 x g per 10 minuti per trasferire il prodotto di reazione nei pozzetti della piastra del prodotto.
Verificare che il volume di liquido in ogni pozzetto sia approssimativamente lo stesso. Quindi, utilizzando un lettore di piastre, leggere l'assorbanza della piastra di raccolta a 517 nanometri per la paglia di grano rosso ICB.