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Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 4:31 min • July 8th, 2025
I mitocani sono una classe di farmaci che influenzano selettivamente il funzionamento dei mitocondri nelle cellule tumorali e inducono l'apoptosi.
Per determinare la citotossicità del mitocan, seminare una sospensione cellulare contenente cellule tumorali semiaderenti su una piastra a più pozzetti. Trattare la piastra con la soluzione di mitocan desiderata e incubare.
Il mitocan entra nella cellula tumorale per interromperne l'attività mitocondriale, portando infine alla morte cellulare nelle cellule tumorali sensibili al mitocan. Trattare le cellule con una soluzione colorante contenente una miscela di colorante Hoechst e ioduro di propidio.
Hoechst, un colorante fluorescente permeabile alla membrana, penetra in tutte le cellule e si lega alla regione ricca di AT del loro DNA, conferendo una fluorescenza blu ai nuclei di cellule vive e morte.
Al contrario, lo ioduro di propidio, un colorante fluorescente impermeabile alla membrana, entra esclusivamente nelle cellule morte attraverso le parti danneggiate delle loro membrane. Il colorante si intercala tra le basi del DNA, conferendo un'ulteriore fluorescenza rossa alle cellule morte. La presenza di entrambi i coloranti nei nuclei di queste cellule fa apparire le cellule morte violacee.
Centrifugare la piastra a bassa velocità per stabilizzare le celle e ottenere una maggiore precisione durante l'imaging. Immagine al microscopio a fluorescenza e osservazione di due distinte popolazioni cellulari. Conta il numero di entrambi i tipi di celle.
La percentuale di cellule viola che rappresentano la popolazione morta rispetto alla popolazione totale indica il potenziale citotossico del mitocano in esame.
Iniziare preparando le soluzioni dei composti di interesse alla concentrazione desiderata. Assicurati sempre di mescolare i composti agitando accuratamente.
Per misurare la citotossicità di un singolo composto, preparare composti a una concentrazione finale 2X. Se si misura la citotossicità di combinazioni di composti, prepararle a una concentrazione finale 4X.
Preparare i controlli con solo solvente mescolando la stessa quantità di solvente con il mezzo appropriato. Raccogliere le cellule in una provetta conica da 15 millilitri e aliquotare 10 microlitri di sospensione cellulare per la colorazione con blu di tripano. Aggiungere 10 microlitri di blu di tripano allo 0,4% all'aliquota e utilizzare un emocitometro o un contatore di cellule per contare le cellule vitali e non vitali.
Pellettare le celle nella provetta da 15 millilitri a 200 x g per 5 minuti, quindi aspirare o decantare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in un terreno appropriato per il test a una densità cellulare di 3x105 cellule per millilitro. Utilizzare una pipetta multicanale per seminare 50 microlitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
Per i saggi di composti singoli, aggiungere 50 microlitri di soluzione composta 2X in ciascun pozzetto. Per i pozzetti di controllo del solvente, aggiungere 50 microlitri di terreno di prova contenente il solvente alla concentrazione 2X. Per i saggi combinati, aggiungere 25 microlitri di ciascuno dei composti 4X in ciascun pozzetto. Per i pozzetti di controllo di composti singoli, aggiungere 25 microlitri ciascuno di soluzione composta 4X e terreno di prova. Assicurarsi che la concentrazione finale di DMSO non superi lo 0,5%.
Per garantire la riproducibilità, aggiungere i farmaci con la punta della pipetta che tocca il lato dei pozzetti, facendo attenzione ad aggiungere i farmaci in posizioni diverse. Questo passaggio deve essere eseguito molto rapidamente, preferibilmente non impiegando più di 30 minuti per piastra.
Picchiettare delicatamente la piastra per mescolare il contenuto dei pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Quando si è pronti a colorare le cellule con Hoechst 33342 e ioduro di propidio, preparare una soluzione di colorazione fresca 10X e aggiungere 10 microlitri a ciascun pozzetto. Picchiettare delicatamente la piastra e incubarla a 37 gradi Celsius per 15 minuti.
Centrifugare la piastra a 200 x g per 4 minuti per portare tutte le celle sul fondo della piastra. Quindi, pulire accuratamente il fondo della piastra con un panno da laboratorio umido per rimuovere eventuali detriti che potrebbero interferire con l'imaging. Immagine della piastra entro 15 minuti dalla centrifugazione.