Saggio di legame dell'annessina V: una tecnica basata sulla fluorescenza per identificare gli eritrociti apoptotici tramite marcatura della fosfatidilserina

Durante determinate condizioni patologiche, gli eritrociti o i globuli rossi subiscono un restringimento cellulare accompagnato dalla traslocazione del fosfolipide di membrana - fosfatidilserina - dal lembo di membrana interno a quello esterno, portando alla morte cellulare programmata, all'eriptosi, innescando la fagocitosi cellulare mediata dai macrofagi.

Per misurare l'eriptosi indotta da ionofori in una popolazione di eritrociti umani isolata tramite il saggio di legame dell'annessina V, iniziare con gli eritrociti sospesi in un tampone privo di glucosio.

La deplezione del glucosio induce stress cellulare, attivando la proteina chinasi citosolica C, che successivamente attiva i canali del calcio e provoca l'afflusso di ioni calcio. Inoltre, i canali del potassio vengono attivati, causando efflusso di potassio e restringimento cellulare.

Successivamente, aggiungi lo ionoforo di calcio che forma un complesso stabile con ioni calcio extracellulari. Il complesso facilita l'ingresso citosolico degli ioni calcio attraverso la membrana cellulare, aumentando ulteriormente la concentrazione intracellulare di calcio. Questo, a sua volta, attiva la scramblase - un trasportatore bidirezionale dei fosfolipidi - che aiuta nella traslocazione della fosfatidilserina dal lembo della membrana cellulare interna a quella esterna, riducendo l'asimmetria della membrana e inducendo l'eroptosi.

Centrifugare gli eritrociti trattati con ionoforo. Risospendere le cellule in un tampone legante contenente calcio. Aggiungere la soluzione di annessina V coniugata con colorante fluorescente.

La proteina legante i fosfolipidi calcio-dipendente, l'annessina V, con un'elevata affinità per la fosfatidilserina si lega ai residui di fosfatidilserina esposti sul foglietto esterno della membrana cellulare.

Utilizzando la selezione cellulare attivata da fluorescenza, separare la popolazione eritrocitaria in base all'intensità di fluorescenza dell'annessina V. Gli eritrociti eriptotici mostrano una maggiore intensità di fluorescenza dell'annessina V rispetto agli eritrociti sani.

Diluire 2 millilitri del tampone legante 5X Annexin V in 8 millilitri di PBS per ottenere il tampone legante 1X. Risospendere i pellet cellulari trattati con ionomicina e non trattati in 1 millilitro del tampone legante 1X.

Prelevare 235 microlitri di sospensioni cellulari nel tampone di legame e aggiungere 15 microlitri di annessina V-Alexa Fluor 488 coniugato in una provetta da microcentrifuga. Incubare le cellule a temperatura ambiente per 20 minuti in un luogo buio.

Centrifugare a 700 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante. Lavare le celle due volte con il tampone legante 1X sospendendo il pellet cellulare in 1,5 millilitri del tampone legante e centrifugando a 700 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.

Rimuovere il surnatante e risospendere i pellet cellulari in 250 microlitri di tampone legante 1X per le misure di citometria a flusso. Ora, trasferire 200 microlitri di eritrociti colorati con Annessina V in provette di polistirene a fondo tondo da 1 millilitro compatibili con la citometria a flusso.

Accedi al software di citometria a flusso e fai clic sul pulsante "Nuovo esperimento". Fare clic sul pulsante "Nuovo tubo", selezionare il "Foglio globale" e scegliere "Applica analisi" per misurare l'intensità della fluorescenza con una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 530 nanometri.

Impostare il numero di cellule su 20.000 da raccogliere per l'analisi di smistamento cellulare attivata dalla fluorescenza. Seleziona il tubo desiderato e fai clic sul pulsante "Carica". Fare clic sul pulsante 'Registra' per le misurazioni della dispersione diretta e laterale. Ripetere l'operazione per tutti i campioni.

Fare clic con il pulsante destro del mouse sul pulsante "Campione" e fare clic su "Applica analisi batch" per generare il file dei risultati. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul pulsante "Campione" e fare clic su "Genera file FSC".