Saggio in vitro di deplezione del glucosio: un metodo basato sulla fluorescenza per quantificare l'assorbimento cellulare del glucosio tramite la misurazione della deplezione extracellulare del glucosio

Il glucosio, una fonte primaria di energia cellulare, entra nelle cellule attraverso le proteine trasportatrici del glucosio della membrana cellulare. Il glucosio viene scomposto nel citoplasma cellulare in piruvato, attraverso la via glicolitica, generando energia attraverso l'adenosina trifosfato, o ATP, per il metabolismo cellulare.

Per misurare l'assorbimento intracellulare del glucosio, iniziare con una coltura aderente di fibroblasti in una piastra a più pozzetti. Sostituire il terreno con terreno privo di glucosio e incubare. Le cellule metabolizzano il glucosio disponibile per produrre energia, raggiungendo uno stato di carenza di glucosio.

Sostituire il terreno in una serie di pozzetti con terreni privi di glucosio contenenti insulina, uno stimolatore dell'assorbimento del glucosio e deossiglucosio fluorescente, un analogo del glucosio. Trattare un'altra serie di pozzetti con terreni privi di glucosio contenenti desossiglucosio fluorescente.

Durante l'incubazione, l'insulina stimola la traslocazione di ulteriori trasportatori di glucosio sulla membrana plasmatica, facilitando l'aumento dell'assorbimento di desossiglucosio fluorescente, in assenza di glucosio.

Il desossiglucosio viene fosforilato e non metabolizzato ulteriormente dalle cellule. Contemporaneamente, la concentrazione extracellulare di desossiglucosio fluorescente diminuisce.

Dopo l'incubazione, raccogliere i terreni contenenti desossiglucosio fluorescente non utilizzato. Trattare le cellule con un tampone di lisi. Il detergente nel tampone forma micelle e solubilizza le membrane cellulari, provocando il rilascio di contenuto intracellulare.

Utilizzando un lettore di micropiastre, misurare la fluorescenza dell'omogenato cellulare contenente desossiglucosio fluorescente intracellulare e dei terreni contenenti desossiglucosio fluorescente extracellulare non utilizzato.

I fibroblasti stimolati con insulina mostrano un aumento dell'assorbimento intracellulare di desossiglucosio fluorescente e una corrispondente diminuzione del desossiglucosio fluorescente extracellulare rispetto alle cellule non stimolate.

Utilizzare 8 repliche per ogni condizione di simulazione. Pertanto, preparare 1 millilitro per ogni condizione di simulazione.

Utilizza 7 condizioni di simulazione senza insulina: FD-glucosio di 2,5 microgrammi per millilitro, 1 microgrammo per millilitro, 0,5 microgrammi per millilitro, 0,2 microgrammi per millilitro, 0,1 microgrammi per millilitro, 0,05 microgrammi per millilitro e 0 milligrammi per millilitro in una piastra a 96 pozzetti.

Utilizzare 7 condizioni di stimolazione con insulina: FD-glucosio di 2,5 microgrammi per millilitro, 1 microgrammo per millilitro, 0,5 microgrammi per millilitro, 0,2 microgrammi per millilitro, 0,1 microgrammi per millilitro, 0,05 microgrammi per millilitro e 0 microgrammi per millilitro in un'altra piastra a 96 pozzetti.

Per preparare le condizioni di stimolazione, diluire 1 microlitro di 5 milligrammi per millilitro di soluzione di lavoro FD-glucosio e 999 microlitri di DMEM privo di glucosio per ottenere 1 millilitro di soluzione madre di lavoro.

Utilizzando questa soluzione di lavorazione, preparare diluizioni 1:2000, 1:5000, 1:10000, 1:25000, 1:50000 e 1:100.000 di FD-glucosio per ottenere 2,5 microgrammi per millilitro, 1 microgrammo per millilitro, 0,5 microgrammi per millilitro, 0,2 microgrammi per millilitro, 0,1 microgrammi per millilitro, 0,05 microgrammi per millilitro in provette da 2 millilitri immediatamente prima degli esperimenti in una cabina di biosicurezza senza luci. Aggiungere 1 microlitro di insulina a ciascuna di queste condizioni.

Dopo 40 minuti di incubazione, decantare il DMEM privo di glucosio da ciascun pozzetto in piastre da 96 pozzetti e assorbire il liquido rimanente con carta assorbente sterile. Aggiungere 100 microlitri ciascuno dalle varie condizioni di trattamento descritte in precedenza, ai pozzetti lungo una colonna, e 100 microlitri dalla stessa condizione di trattamento ai pozzetti lungo la fila in entrambe le piastre a 96 pozzetti. Etichettare le piastre che hanno utilizzato le condizioni con e senza insulina.

Aggiungere il solo DMEM privo di glucosio ai pozzetti di controllo. Incubare la piastra per 40 minuti in un incubatore per colture cellulari al buio.

Dopo che le cellule sono state stimolate per 40 minuti, trasferire il mezzo di stimolazione da entrambe le piastre in nuove piastre da 96 pozzetti, mantenendo lo stesso layout sperimentale. Lavare le celle con PBS. Rimuovere il PBS e decantare la soluzione rimanente su salviette di carta sterili.

Aggiungere un inibitore della proteasi al tampone del saggio di radioimmunoprecipitazione per proteggere le proteine. Porre le piastre contenenti il saggio di radioimmunoprecipitazione in un agitatore per 30 minuti.

Utilizzando un lettore di micropiastre, misurare la fluorescenza a lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione rispettivamente di 485 e 535 nanometri, prima, nel terreno contenente FD-glucosio extracellulare e poi, nella piastra con cellule lisate con saggio di radioimmunoprecipitazione al termine di 30 minuti di incubazione.