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Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:04 min • July 8th, 2025
Nei tessuti, il glucosio extracellulare entra nelle cellule attraverso la diffusione facilitata attraverso specifici trasportatori di glucosio.
Il glucosio viene scomposto in piruvato nel citoplasma cellulare attraverso la glicolisi, una via metabolica, generando energia sotto forma di adenosina trifosfato, o ATP, per i processi metabolici cellulari.
Per misurare l'assorbimento del glucosio ex vivo, iniziare con il tessuto epatico di topo di piccole dimensioni appena raccolto. Aggiungere un tampone adatto per mantenere le condizioni fisiologiche.
Quindi, trasferire il tessuto in una piastra a più pozzetti contenente terreni privi di glucosio. Seguirlo mediante incubazione in terreni privi di glucosio integrati con deossiglucosio, un analogo del glucosio marcato in fluorescenza. Le piccole dimensioni del tessuto consentono l'ingresso del desossiglucosio.
Il desossiglucosio entra nelle cellule attraverso i trasportatori del glucosio, in assenza di glucosio. All'interno delle cellule, il desossiglucosio subisce fosforilazione ma non viene ulteriormente metabolizzato, portando al suo accumulo.
Raccogliere il terreno contenente desossiglucosio marcato con fluorescenza non utilizzato nei punti temporali desiderati. Utilizzando un lettore di micropiastre, misurare la fluorescenza del desossiglucosio extracellulare, che può essere correlata con l'assorbimento tissutale intracellulare del desossiglucosio.
Incubare i tessuti o gli organi prelevati in una piastra a 6 pozzetti contenente PBS per un minuto. Maneggiare ogni tessuto o organo in un pozzetto separato. Dopo un minuto, posizionare ogni fazzoletto su un tovagliolo di carta sterile per assorbire il PBS.
Trasferire tessuti o organi in una piastra separata a 6 pozzetti contenente 4.000 microlitri di DMEM privo di glucosio e incubare per due minuti. Dopo due minuti, rimuovere e trasferire i tessuti nei pozzetti di una piastra a 6 pozzetti contenente 0,29 millimolari di soluzione di lavoro FD-glucosio. Incubare le piastre a 6 pozzetti contenenti tessuti in soluzione di lavoro FD-glucosio a 37 gradi Celsius.
Raccogliere 100 microlitri di soluzione di lavoro FD-glucosio da ciascun pozzetto dopo 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 e 120 minuti di incubazione e trasferire i 100 microlitri raccolti di soluzione di lavoro FD-glucosio in piastre a 96 pozzetti per analizzare la cinetica della deplezione extracellulare di FD-glucosio. Agitare prima e dopo la raccolta.
Misurare la fluorescenza a lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione rispettivamente di 485 e 535 nanometri utilizzando un lettore di micropiastre.