Il saggio del filamento di actina scorrevole: un test di motilità in vitro per studiare la traslocazione dei filamenti di actina su miosine immobilizzate

La miosina, una proteina motrice, interagisce con un'altra proteina filamentosa, l'actina, causandone la traslocazione.

Per analizzare il movimento di scorrimento dell'actina, assemblare una camera di flusso basata su vetrini in modo tale che la parte interna della parte superiore della camera sia rivestita di nitrocellulosa. Fluiscono le proteine della miosina attraverso la camera, che si immobilizzano sul rivestimento di nitrocellulosa.

Integrare la camera con filamenti di actina non marcati - actine nere - e aggiungere un tampone di motilità contenente adenosina trifosfato o molecole di ATP.

I filamenti di actina si legano alle miosine attive immobilizzate insieme alle miosine inattive o morte. Le molecole di ATP interagiscono con le miosine attive, portando alla loro dissociazione dalle actine nere, mentre le miosine inattive rimangono legate all'actina.

Centrifuga per pellettizzare le miosine inattive attaccate alle actine nere. Risciacquare accuratamente con un tampone per rimuovere il pellet di miosina inattivo, i filamenti di actina liberi e gli ATP inutilizzati. Flusso in actine marcate in fluorescenza che legano miosine attive immobilizzate.

Integrare la camera con un tam