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Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:24 min • July 8th, 2025
L'adenosina trifosfato, ATP, la principale fonte di energia delle cellule, è vitale per diverse funzioni cellulari. Sotto stress, i livelli intracellulari di ATP sono influenzati negativamente, rendendo l'ATP un buon marcatore per le cellule metabolicamente attive e vitali.
Per iniziare, seminare la sospensione delle cellule tumorali in una micropiastra a parete nera a fondo trasparente per ridurre al minimo la dispersione della luce durante la misurazione dell'intensità della luce. La micropiastra è costituita da un rivestimento in idrogel che impedisce alle cellule di aderire alla piastra, consentendo l'interazione cellula-cellula e l'autoassemblaggio in organoidi tumorali, colture di tessuti tridimensionali che imitano il microambiente tumorale.
Quindi, trattare con un composto di prova. Il composto in esame interagisce con le cellule organoidi e, a seconda del suo potenziale inibitorio della crescita, può interrompere i processi metabolici che producono energia, con conseguente deplezione intracellulare dell'ATP.
Dopo il trattamento, aggiungere un reagente in un'unica fase comprendente detergenti, inibitori dell'ATPasi, l'enzima luciferasi, substrato specifico della luciferasi, luciferina e ioni magnesio. Incubare per la durata desiderata.
Il detergente solubilizza le membrane cellulari, provocando la lisi cellulare e l'estrazione dell'ATP in soluzione, mentre gli inibitori dell'ATPasi inattivano le ATPasi endogene rilasciate, stabilizzando l'ATP.
Dopo la sua estrazione, l'ATP, in presenza di ioni magnesio, facilita il legame della luciferina con la luciferasi, che ossida la luciferina in ossiluciferina ad alta energia che, dopo il rilassamento, genera un fotone bioluminescente.
Utilizzando un luminometro, misurare l'intensità della luce prodotta dai fotoni, rappresentativa della concentrazione intracellulare di ATP. Quantità più basse di ATP indicano una minore vitalità cellulare, suggerendo un maggiore potenziale inibitorio della crescita del composto in esame.
Dopo 24 ore di cambio del terreno, tritare gli organoidi tumorali utilizzando uno strumento di frammentazione e dispersione cellulare, dotato di un portafiltro contenente un filtro a maglie da 70 micrometri. Diluire 15 millimetri di sospensione di organoidi tumorali 10 volte.
Utilizzare il dispenser di sospensione cellulare per seminare 40 microlitri di sospensione di organoidi tumorali diluiti in una micropiastra di sferoidi a bassissimo attacco da 384 pozzetti.
Dopo 24 ore, utilizzare un gestore di liquidi per aggiungere 0,04 microlitri di soluzioni di agente di prova da 10 diluizioni seriali a intervalli di concentrazione finali da 20 micromolari a 1,0 nanomolari nei pozzetti e incubare la piastra per 6 giorni.
Al termine dell'incubazione, aggiungere il reagente intracellulare per la misurazione dell'ATP nei pozzetti del test. Utilizzare un mixer per mescolare il contenuto della piastra e incubare la piastra per 10 minuti a circa 25 gradi Celsius. Utilizzare un lettore di piastre per misurare il contenuto intracellulare di ATP sotto forma di luminescenza.