Saggio di citometria a flusso per quantificare lo stress ossidativo: un test per quantificare le specie reattive dell'ossigeno negli organoidi intestinali utilizzando sonde fluorogeniche

Le cellule intestinali producono specie reattive dell'ossigeno - ROS. Livelli moderati di ROS mantengono l'omeostasi cellulare, mentre alti livelli di ROS possono causare la morte cellulare.

Per quantificare i livelli di ROS in vitro, iniziare con una coltura di organoidi 3D intestinali di topo. Questi organoidi presentano un'architettura dell'epitelio intestinale con sporgenze simili a cripte che ospitano cellule staminali verdi che esprimono fluorescenza. Contengono anche cellule differenziate simili a villi alla periferia, che circondano il lume centrale che comprende cellule morte e detriti. Tutte queste cellule producono diversi livelli di ROS.

Ora, trattare gli organoidi nei pozzetti designati con modulatori ROS. In base alla loro natura, i modulatori possono agire come induttori o inibitori dei ROS. Dopo l'incubazione per la durata richiesta, rimuovere il terreno esaurito.

Aggiungere un enzima proteolitico alla coltura, interrompendo l'architettura 3D degli organoidi e rilasciando diverse cellule in sospensione. Quindi, aggiungere una sonda fluorogenica sensibile ai ROS e incubare.

Entrando nelle cellule, le sonde reagiscono con i ROS e si ossidano per produrre fluorescenza