Saggio di citometria a flusso per quantificare lo stress ossidativo: un test per quantificare le specie reattive dell'ossigeno negli organoidi intestinali utilizzando sonde fluorogeniche
JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:29 min • July 8th, 2025
Le cellule intestinali producono specie reattive dell'ossigeno - ROS. Livelli moderati di ROS mantengono l'omeostasi cellulare, mentre alti livelli di ROS possono causare la morte cellulare.
Per quantificare i livelli di ROS in vitro, iniziare con una coltura di organoidi 3D intestinali di topo. Questi organoidi presentano un'architettura dell'epitelio intestinale con sporgenze simili a cripte che ospitano cellule staminali verdi che esprimono fluorescenza. Contengono anche cellule differenziate simili a villi alla periferia, che circondano il lume centrale che comprende cellule morte e detriti. Tutte queste cellule producono diversi livelli di ROS.
Ora, trattare gli organoidi nei pozzetti designati con modulatori ROS. In base alla loro natura, i modulatori possono agire come induttori o inibitori dei ROS. Dopo l'incubazione per la durata richiesta, rimuovere il terreno esaurito.
Aggiungere un enzima proteolitico alla coltura, interrompendo l'architettura 3D degli organoidi e rilasciando diverse cellule in sospensione. Quindi, aggiungere una sonda fluorogenica sensibile ai ROS e incubare.
Entrando nelle cellule, le sonde reagiscono con i ROS e si ossidano per produrre fluorescenza rossa. Trattare le cellule con DAPI - un colorante fluorescente legante il DNA - che colora selettivamente i nuclei delle cellule morte - creando un contrasto con le cellule vive.
Utilizzando un citometro a flusso, analizzare le cellule vive DAPI-negative per ottenere un segnale di fluorescenza rosso corrispondente al loro livello di ROS. A seconda della natura dei modulatori, gli induttori aumentano i livelli di ROS mentre gli inibitori li diminuiscono.
Aggiungere 1 microlitro della soluzione madre di N-acetil cisteina nei pozzetti di controllo negativo della piastra a fondo tondo a 96 pozzetti contenente gli organoidi.
Dopo un'incubazione di 1 ora, aggiungere 1 microlitro di soluzione madre di terz-butilidroossido di terz-butile nei pozzetti corrispondenti e incubare per 30 minuti. Quindi, utilizzando una pipetta multicanale, rimuovere il fluido senza disturbare il BMM collegato e trasferirlo in un'altra piastra a fondo tondo a 96 pozzetti. Tenete da parte questo piatto.
Quindi, aggiungere 100 microlitri di tripsina e, utilizzando una pipetta multicanale, pipettare su e giù cinque volte per distruggere il BMM. Dopo una breve incubazione di 5 minuti, dissociare gli organoidi pipettandoli su e giù una seconda volta.
Girare la piastra e scartare il surnatante capovolgendo la piastra. Aggiungere nuovamente il terreno precedentemente raccolto in un'altra piastra a 96 pozzetti nei pozzetti corrispondenti e risospendere le cellule pipettando su e giù cinque volte.
Quindi, aggiungere 1 microlitro di sonda fluorogenica e incubare per 30 minuti. Quindi, girare nuovamente la piastra e risospendere le cellule con 250 microlitri di soluzione DAPI. Trasferire i campioni in provette per citometria a flusso e mantenere le provette sul ghiaccio.
Ottimizza le impostazioni della tensione di dispersione diretta e laterale su tensioni di controllo e laser non colorate, per ogni fluoroforo utilizzando campioni monocolorati. Quindi, utilizzando una strategia di gating appropriata, raccogli un minimo di 20.000 eventi.
Panoramica
Questo studio analizza la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) in organoidi tridimensionali intestinali di topo. Esplora gli effetti dei modulatori delle ROS sull'omeostasi cellulare e sulla vitalità cellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Stress ossidativo
Sfondo
- Le cellule intestinali producono livelli variabili di ROS.
- Livelli moderati di ROS sono essenziali per l'omeostasi cellulare.
- Un eccesso di ROS può portare alla morte cellulare.
- Comprendere la dinamica dei ROS è fondamentale per la salute intestinale.
Scopo dello studio
- Quantificare i livelli di ROS negli organoidi intestinali.
- Valutare l'impatto di inductor e inibitori di ROS.
- Analizzare la vitalità cellulare in relazione ai livelli di ROS.
Metodi Utilizzati
- Coltura di organoidi tridimensionali intestinali di topo.
- Trattamento con modulatori delle specie reattive dell'ossigeno (ROS).
- Analisi mediante citometria a flusso dei livelli di ROS mediante sonde fluorogeniche.
- Utilizzo di DAPI per distinguere cellule vive e morte.
Risultati principali
- I livelli di ROS variavano tra i diversi tipi cellulari negli organoidi.
- Gli induttori aumentavano i livelli di ROS, mentre gli inibitori li riducevano.
- La citometria a flusso ha quantificato efficacemente i ROS nelle cellule vive.
- La vitalità cellulare è stata valutata mediante colorazione con DAPI.
Conclusioni
- Le ROS svolgono un ruolo fondamentale nella funzione delle cellule intestinali.
- I modulatori possono alterare efficacemente i livelli di ROS negli organoidi.
- Questo metodo fornisce informazioni sullo stress ossidativo nelle cellule intestinali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo saggio di citometria a flusso consente la misurazione quantitativa delle specie reattive dell'ossigeno in organoidi intestinali 3D, fornendo un modello fisiologicamente rilevante per valutare gli effetti dei composti sulle vie dello stress ossidativo. Supporta la validazione del bersaglio e la riduzione del rischio meccanicistico nella fase iniziale della scoperta, collegando la modulazione delle ROS agli esiti cellulari in un sistema rilevante per la malattia. Il saggio fornisce dati quantitativi e riproducibili che possono guidare decisioni di avanzamento o interruzione nell'identificazione dei composti promettenti e nella priorizzazione preclinica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche quantificando le variazioni delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) in risposta a modulatori, chiarificando il coinvolgimento delle vie nel processo di stress ossidativo.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale di bersagli associati alla regolazione delle ROS mediante un modello di organoidi intestinali rilevante per la patologia.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio fornendo letture quantitative dose-dipendenti che correlano l'attività del composto con l'effetto biologico.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera output fluorescenti standardizzati e quantitativi da organoidi dissociati, adatti per schermature ad alto rendimento mediante citometria a flusso.
- Riproducibilità: Utilizza un'analisi con porte su cellule vitali DAPI-negative per garantire misurazioni del segnale di ROS costanti tra esperimenti.
- Scalabilità: Compatibile con formati a piastre da 96 pozzetti e pipettatura multicanale, consentendo test paralleli su composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Modella lo stress ossidativo intestinale umano utilizzando organoidi murini con architettura dell'epitelio intestinale e strutture differenziate simili a villi.
- Continuità traslazionale: Collega la scoperta al lavoro preclinico fornendo un biomarcatore quantificabile (flusso di ROS) per la conferma del meccanismo d'azione.
- Decisioni basate sul rischio: Permette la valutazione dello stress ossidativo indotto dal composto come indicatore di sicurezza o efficacia prima di studi in vivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto promettente fino alla valutazione preclinica, fornendo un'analisi quantitativa dello stress ossidativo che orienta il progresso del composto.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi misurando le specie reattive dell'ossigeno (ROS) come output funzionale della modulazione del percorso cellulare nelle cellule epiteliali intestinali.
- Screening: Fornisce dati quantitativi di fluorescenza pronti per il saggio, consentendo un confronto affidabile degli effetti dei composti sui livelli di ROS.
- Analisi: Offre una quantificazione basata sulla citometria a flusso della fluorescenza rossa in cellule vive, permettendo il confronto statistico dell'induzione o inibizione di ROS.
- Ricerca traslazionale: Si collega a studi preclinici attraverso un fenotipo misurabile e rilevante per la malattia legato allo stress ossidativo, monitorabile in diversi modelli.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un metodo standardizzato e trasferibile per la valutazione dello stress ossidativo, applicabile in diversi programmi mirati al tratto gastrointestinale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva collegando il trattamento con il composto a modifiche quantificabili delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) in un modello fisiologicamente rilevante.
- Valore operativo: Fornisce un flusso di lavoro standardizzato e riproducibile, dalla coltura di organoidi all'analisi mediante citometria a flusso, riducendo al minimo la variabilità.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione sviluppando un'analisi meccanicistica precoce del rischio o dell'efficacia legata allo stress ossidativo.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei composti in base al rischio calibrato, in funzione del loro effetto sull'omeostasi delle ROS in tessuti rilevanti per la malattia.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nella coltura di organoidi 3D, nella citometria a flusso e nella manipolazione di sonde fluorescenti.
- Dipende dall'accesso a un citometro a flusso dotato di canali di fluorescenza adeguati e controlli di compensazione.
- Necessita della standardizzazione delle procedure di dissociazione e colorazione degli organoidi tra diversi utilizzatori e sedi.
- È necessario tenere conto della variabilità nella dimensione degli organoidi e nel loro stato di differenziazione durante l'interpretazione dei segnali di ROS.
- Limitato ai modelli ex vivo; non tiene conto del metabolismo sistemico né delle influenze del microbioma sui ROS.
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Ultimo aggiornamento: 29 agosto 2026