JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:29 min • July 8th, 2025
Le cellule intestinali producono specie reattive dell'ossigeno - ROS. Livelli moderati di ROS mantengono l'omeostasi cellulare, mentre alti livelli di ROS possono causare la morte cellulare.
Per quantificare i livelli di ROS in vitro, iniziare con una coltura di organoidi 3D intestinali di topo. Questi organoidi presentano un'architettura dell'epitelio intestinale con sporgenze simili a cripte che ospitano cellule staminali verdi che esprimono fluorescenza. Contengono anche cellule differenziate simili a villi alla periferia, che circondano il lume centrale che comprende cellule morte e detriti. Tutte queste cellule producono diversi livelli di ROS.
Ora, trattare gli organoidi nei pozzetti designati con modulatori ROS. In base alla loro natura, i modulatori possono agire come induttori o inibitori dei ROS. Dopo l'incubazione per la durata richiesta, rimuovere il terreno esaurito.
Aggiungere un enzima proteolitico alla coltura, interrompendo l'architettura 3D degli organoidi e rilasciando diverse cellule in sospensione. Quindi, aggiungere una sonda fluorogenica sensibile ai ROS e incubare.
Entrando nelle cellule, le sonde reagiscono con i ROS e si ossidano per produrre fluorescenza rossa. Trattare le cellule con DAPI - un colorante fluorescente legante il DNA - che colora selettivamente i nuclei delle cellule morte - creando un contrasto con le cellule vive.
Utilizzando un citometro a flusso, analizzare le cellule vive DAPI-negative per ottenere un segnale di fluorescenza rosso corrispondente al loro livello di ROS. A seconda della natura dei modulatori, gli induttori aumentano i livelli di ROS mentre gli inibitori li diminuiscono.
Aggiungere 1 microlitro della soluzione madre di N-acetil cisteina nei pozzetti di controllo negativo della piastra a fondo tondo a 96 pozzetti contenente gli organoidi.
Dopo un'incubazione di 1 ora, aggiungere 1 microlitro di soluzione madre di terz-butilidroossido di terz-butile nei pozzetti corrispondenti e incubare per 30 minuti. Quindi, utilizzando una pipetta multicanale, rimuovere il fluido senza disturbare il BMM collegato e trasferirlo in un'altra piastra a fondo tondo a 96 pozzetti. Tenete da parte questo piatto.
Quindi, aggiungere 100 microlitri di tripsina e, utilizzando una pipetta multicanale, pipettare su e giù cinque volte per distruggere il BMM. Dopo una breve incubazione di 5 minuti, dissociare gli organoidi pipettandoli su e giù una seconda volta.
Girare la piastra e scartare il surnatante capovolgendo la piastra. Aggiungere nuovamente il terreno precedentemente raccolto in un'altra piastra a 96 pozzetti nei pozzetti corrispondenti e risospendere le cellule pipettando su e giù cinque volte.
Quindi, aggiungere 1 microlitro di sonda fluorogenica e incubare per 30 minuti. Quindi, girare nuovamente la piastra e risospendere le cellule con 250 microlitri di soluzione DAPI. Trasferire i campioni in provette per citometria a flusso e mantenere le provette sul ghiaccio.
Ottimizza le impostazioni della tensione di dispersione diretta e laterale su tensioni di controllo e laser non colorate, per ogni fluoroforo utilizzando campioni monocolorati. Quindi, utilizzando una strategia di gating appropriata, raccogli un minimo di 20.000 eventi.