Saggio di SUMOilazione: una tecnica in vitro per rilevare lo stato di SUMOilazione delle proteine del substrato mediante immunoblotting
JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 6:00 min. • July 8th, 2025
La SUMOilazione si verifica a causa dell'attaccamento di piccoli modificatori simili all'ubiquitina, i SUMO, alle proteine del substrato.
La SUMOilazione si verifica quando un peptide SUMO maturo viene attivato da un enzima - E1. Dopo l'attivazione, il SUMO viene trasferito al sito attivo dell'enzima coniugato - E2 - legando il SUMO al residuo di lisina della proteina substrato. Un'altra ligasi - E3 - migliora l'efficienza di questa interazione.
Per eseguire un saggio di SUMOilazione in vitro, iniziare con una provetta contenente una miscela della proteina substrato - p53, enzimi e peptidi SUMO e incubare per indurre la SUMOilazione. Integrare la provetta con sodio dodecil solfato - tampone contenente SDS, terminando la reazione. Riscaldare il campione per denaturare le proteine.
Caricare la miscela proteica nel pozzetto di un gel SDS-PAGE ed eseguire l'elettroforesi. Le proteine SUMOilate a più alto peso molecolare si muovono più lentamente rispetto alle loro varianti non SUMOilate, generando due bande distinte.
Trasferire il gel su una membrana assorbente presente su una carta da filtro bagnata in un apparecchio per elettroblotting. Coprire con carta da filtro bagnata e trasferir
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