Saggio di SUMOilazione: una tecnica in vitro per rilevare lo stato di SUMOilazione delle proteine del substrato mediante immunoblotting

La SUMOilazione si verifica a causa dell'attaccamento di piccoli modificatori simili all'ubiquitina, i SUMO, alle proteine del substrato.

La SUMOilazione si verifica quando un peptide SUMO maturo viene attivato da un enzima - E1. Dopo l'attivazione, il SUMO viene trasferito al sito attivo dell'enzima coniugato - E2 - legando il SUMO al residuo di lisina della proteina substrato. Un'altra ligasi - E3 - migliora l'efficienza di questa interazione.

Per eseguire un saggio di SUMOilazione in vitro, iniziare con una provetta contenente una miscela della proteina substrato - p53, enzimi e peptidi SUMO e incubare per indurre la SUMOilazione. Integrare la provetta con sodio dodecil solfato - tampone contenente SDS, terminando la reazione. Riscaldare il campione per denaturare le proteine.

Caricare la miscela proteica nel pozzetto di un gel SDS-PAGE ed eseguire l'elettroforesi. Le proteine SUMOilate a più alto peso molecolare si muovono più lentamente rispetto alle loro varianti non SUMOilate, generando due bande distinte.

Trasferire il gel su una membrana assorbente presente su una carta da filtro bagnata in un apparecchio per elettroblotting. Coprire con carta da filtro bagnata e trasferire elettro-le proteine dal gel sulla membrana.

Trattare la membrana con anticorpi anti-p53, che si legano a p53. Sovrapposizione con anticorpi secondari coniugati con enzimi che si legano ai complessi anticorpo-p53. Aggiungere un substrato chemiluminescente per generare un prodotto luminescente e visualizzare l'immagine della membrana.

Una banda di peso molecolare più alta corrisponde alle proteine SUMOilate, mentre la banda più bassa corrisponde alle varianti proteiche non SUMOilate.

Aggiungere 3 microlitri da 100 nanogrammi per microlitro di tag-K-bZIP purificato nella reazione master mix di SUMOilazione in vitro. Quindi, mescolare delicatamente il contenuto della miscela master e incubare a 30 gradi Celsius per 3 ore.

Quindi, aggiungere 20 microlitri di 2x SDS-PAGE con tampone di caricamento per fermare la reazione. Quindi, riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per 5 minuti per denaturare la proteina.

Successivamente, caricare 20 microlitri di campione su un gel SDS-PAGE al 10% e far scorrere il gel a 80 volt per circa 120 minuti fino a quando il colorante raggiunge il fondo del gel.

Una volta terminata l'elettroforesi, scollegare l'apparato in gel e trasferire il gel in un tampone di trasferimento semi-secco per 5 minuti. Quindi, immergere la membrana PVDF in un altro contenitore riempito di metanolo per 1 minuto.

Rimuovere la membrana in PVDF dal metanolo e immergerla in un tampone di trasferimento semi-secco. Quindi, agitare delicatamente la membrana per 5 minuti.

Rimuovere il coperchio di sicurezza dell'apparecchio elettroforetico semisecco. Pre-bagnare una carta da filtro e preparare un sandwich di gel sul fondo dell'anodo di platino. Dopo aver fissato la piastra catodica nel coperchio di sicurezza, far funzionare il blot a 15 volt di corrente costante per 90 minuti. Quindi, spegnere l'alimentazione ed estrarre la membrana in PVDF, dopo aver scollegato l'apparecchio semisecco.

Ora, bloccare la membrana in PVDF con tampone di bloccaggio, per 1 ora a temperatura ambiente su un agitatore orbitale a 30 giri al minuto. Successivamente, ibridare la membrana PVDF con l'anticorpo anti-p53 e il tampone bloccante per 12-16 ore a 4 gradi Celsius, su un miscelatore in sospensione a 30 giri al minuto.

Quindi, estrarre la membrana in PVDF e trasferirla in un contenitore riempito con soluzione fisiologica tamponata TRIS con Tween-20. Quindi, immergere la membrana PVDF in soluzione salina tamponata TRIS con Tween-20 per 30 minuti sull'agitatore orbitale a 45 giri al minuto. Quindi, ibridare la membrana PVDF con anticorpo anti-coniglio coniugato con perossidasi di rafano diluito in tampone bloccante, per 1 ora a temperatura ambiente sul miscelatore in sospensione a 30 giri al minuto.

Successivamente, lavare tre volte la membrana PVDF con soluzione fisiologica tamponata TRIS con Tween-20. Dopo il lavaggio, immergere la membrana PVDF in soluzione salina tamponata TRIS Tween-20 per 30 minuti sul miscelatore in sospensione a 45 giri al minuto. Quindi, sostituire la soluzione salina tamponata TRIS Tween-20 con soluzione salina tamponata con fosfato per preservare la membrana PVDF a 4 gradi Celsius per un massimo di 12 ore.

Quindi, miscelare i reagenti del substrato chemiluminescente potenziato 1 e 2 in un rapporto 1:1. Quindi, rimuovere la membrana in PVDF dalla soluzione salina tamponata con fosfato e tamponare brevemente con le tasche di perforazione per assorbire l'umidità in eccesso.

Immediatamente, aggiungere 400 microlitri di reagente chemiluminescente sulla superficie della membrana e attendere da 3 a 5 minuti. Tamponare brevemente per drenare il reagente chemiluminescente in eccesso, evitando che la membrana si asciughi completamente. Utilizzare il sistema di imaging a luminescenza per esporre il blot.