JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 2:59 min • July 8th, 2025
Le proteine nucleari mal ripiegate prive di una struttura terziaria definita sono marcate con piccoli modificatori simili all'ubiquitina, SUMO e molecole di ubiquitina, che facilitano la loro degradazione da parte del sistema proteolitico, incluso il sistema ubiquitina-proteasoma, l'UPS.
In diverse malattie neurodegenerative, la disfunzione dell'UPS provoca l'accumulo e l'aggregazione di proteine nucleari mal ripiegate, portando alla morte neuronale.
Per studiare il tasso di degradazione delle proteine nucleari mal ripiegate in vitro, trattare una coltura di cellule di mammifero aderenti con una miscela comprendente un DNA plasmidico codificante una proteina mal ripiegata marcata con fluorescenza e un reagente di trasfezione.
Le cellule trasfettate con successo esprimono proteine mal ripiegate marcate con fluorescenza, a breve emivita, marcate con un segnale di localizzazione nucleare. Dopo il trasporto al nucleo, queste proteine mal ripiegate subiscono la SUMOilazione e l'ubiquitinazione e vengono trasferite all'UPS per la degradazione e la clearance delle proteine.
Dopo l'incubazione, sostituire il terreno con un terreno a bassa fluorescenza contenente cicloesimide. La cicloesimide, una molecola permeabile alle cellule, si lega alla grande unità ribosomiale e blocca la fase di allungamento della traduzione proteica e l'ulteriore sintesi proteica, facilitando lo studio del tasso di degradazione delle proteine mal ripiegate tradotte marcate con fluorescenza.
Trattare una serie di pozzetti con un inibitore del proteasoma per bloccare l'attività del proteasoma e causare l'accumulo di proteine mal ripiegate. Utilizzando un lettore di micropiastre, misurare la fluorescenza delle proteine mal ripiegate.
Un declino dipendente dal tempo della fluorescenza indica una degradazione delle proteine mal ripiegate. Le cellule trattate con l'inibitore del proteasoma mostrano un'intensità di fluorescenza simile nel tempo, denotando l'inibizione della degradazione delle proteine mal ripiegate.
Dopo la semina e la trasfezione delle cellule HeLa in piastre a 96 pozzetti secondo il protocollo di testo, da 20 a 24 ore dopo la trasfezione, esaminare le cellule per verificare l'espressione di GFP. Rimuovere il terreno a circa 200 microlitri di 1x PBS in ciascun pozzetto, quindi aspirarlo per rimuovere il DMEM residuo.
Aggiungere 60 microlitri di DMEM a bassa fluorescenza con il 5% di FBS e 50 microgrammi per millilitro di cicloesimide e aggiungere 10 micromolari di MG132 a una serie di campioni.
Con un lettore di piastre a fluorescenza, misurare il segnale GFP leggendo le piastre ogni ora per un massimo di 8-10 ore. Esporta i dati ed esegui analisi statistiche secondo il protocollo di testo.