Il saggio della luciferasi: un test ad alto rendimento per misurare i segnali luminescenti utilizzando bioreporter ingegnerizzati basati su sistemi di nanoluciferasi
JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 2:36 min. • July 8th, 2025
La luciferasi è un enzima che ossida il suo substrato per formare un prodotto bioluminescente.
Questa proprietà della luciferasi è utile per la progettazione di un sistema reporter basato su nanoluciferasi in cui viene utilizzata la versione divisa dell'enzima. In questo sistema, i frammenti più piccoli e più grandi possiedono un'elevata affinità di legame l'uno verso l'altro e possono ricostituire l'enzima funzionale.
Per utilizzare il sistema a base di nanoluciferasi per rilevare la proteina bersaglio - dominio di legame del recettore della glicoproteina spike di SARS-CoV-2 - iniziare con un piatto di coltura contenente cellule aderenti. Queste cellule contengono un plasmide che codifica per la proteina bersaglio in combinazione con una sequenza specifica per il frammento più piccolo di nanoluciferasi ingegnerizzata.
Dopo l'espressione, le cellule coltivate producono bioreporter, proteine bersaglio ricombinanti fuse con il frammento più piccolo della luciferasi. Trattare le cellule con un tampone di lisi e incubare sotto agitazione. I componenti tampone lisano rapidamente le cellule, rilasciando il contenuto cellulare, compresi i bioreporter, nel surnatante.
Trasferire il surnata
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