Saggio Bioreporter: una tecnica sensibile che utilizza un sistema reporter bioluminescente per rilevare gli anticorpi SARS-CoV-2

Durante l'infezione da sindrome respiratoria acuta grave da coronavirus 2, o SARS-CoV-2, il dominio di legame del recettore della proteina spike del virus, RBD, si lega all'enzima di conversione dell'angiotensina 2 della cellula ospite, ACE2, facilitando l'ingresso delle cellule virali. In risposta, il sistema immunitario produce anticorpi che si legano all'RBD virale e impediscono l'ingresso cellulare, riducendo l'infettività virale.

Per rilevare gli anticorpi SARS-CoV-2 mirati agli RBD, assumere una sospensione bioreporter ricombinante composta da frammenti proteici di piccole dimensioni, fusi con l'RBD spike di SARS-CoV-2. Aggiungere gli anticorpi SARS-CoV-2 standard mirati agli RBD e le microsfere magnetiche leganti gli anticorpi.

Durante l'incubazione, la regione dell'anticorpo Fc si lega ai domini di legame Fc delle perle. Inoltre, il bioreporter ricombinante si lega agli anticorpi SARS-CoV-2 che hanno come bersaglio gli RBD legati alle perline.

Dopo l'incubazione, centrifugare la miscela. Rimuovere il surnatante non legato contenente bioreporter. Risospendere le perline legate nel buffer. Trasferire in una piastra a più pozzetti.

Aggiungere una soluzione contenente frammenti proteici di grandi dimensioni, con un'elevata affinità per frammenti proteici di piccole dimensioni. Frammenti proteici di grandi e piccole dimensioni si legano insieme, formando un enzima luciferasi ingegnerizzato attivo.

Aggiungere la furimazina, un substrato della luciferasi. La luciferasi catalizza l'ossidazione della furimazina, provocando l'emissione di luce. Utilizzando un luminometro, misurare la luminescenza, indicativa della presenza di anticorpi neutralizzanti.

Elevate intensità di segnale suggeriscono alte concentrazioni di anticorpi SARS-CoV-2 mirati agli RBD.

Per eseguire il test di rilevamento degli anticorpi HiBiT-RBD, preparare il bioreporter HiBiT-RBD e combinare 50 microlitri di surnatante contenente HiBiT-RBD con 1 microgrammo di anticorpo SARS-CoV-2-RBD commerciale in una microprovetta da 1,5 millilitri.

Aggiungere 20 microlitri di proteina legante le immunoglobuline, o proteina G, alla soluzione. Porta il volume totale a 300 microlitri aggiungendo PBS. Incubare le provette su un agitatore per provette o un rotatore per 30 minuti, centrifugare a 12.000 x g per 30 secondi, quindi scartare il surnatante e lavare con PBS. Ripetere il processo tre volte per rimuovere l'HiBiT-RBD libero.

Risospendere le cellule in 50 microlitri di PBS e trasferirle in una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 50 microlitri di 1x LgBiT e attendere 5 minuti. Quindi, aggiungere 50 microlitri di substrato 1x NanoLuc. Leggere immediatamente il segnale di luminescenza con un luminometro.