JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:03 min • July 8th, 2025
L'omeostasi cellulare delle proteine, o proteostasi, coinvolge la regolazione del ripiegamento e della funzione delle proteine, insieme alla degradazione delle proteine mal ripiegate. Durante l'invecchiamento, il meccanismo della proteostasi diminuisce, causando l'accumulo e l'ulteriore aggregazione di proteine mal ripiegate, con conseguente disfunzione cellulare.
Per determinare il declino della proteostasi associata all'età, iniziare con Caenorhabditis elegans transgenico adulto sincronizzato con lo sviluppo.
Le cellule muscolari di questi vermi esprimono proteine con ripetizioni di poliglutammina anormalmente espansa, o polyQ, fuse con un tag fluorescente. Le proteine PolyQ sono inclini a ripiegarsi male e, quindi, dopo l'accumulo, possono formare aggregati.
Trasferire i vermi su un vetrino da microscopio composto da un tampone di agarosio e immobilizzarli con un prodotto chimico adatto per l'imaging di cellule vive. Utilizzando un microscopio a fluorescenza, visualizzare i muscoli della parete corporea dei vermi per un periodo di tempo per determinare i segnali luminosi e fluorescenti, corrispondenti agli aggregati polyQ fluorescenti.
Entro pochi giorni, a causa del declino della proteostasi correlata all'età, si verifica un progressivo accumulo di aggregati polyQ, che porta a un numero maggiore di focolai fluorescenti. L'aumento degli aggregati polyQ nelle cellule muscolari causa tossicità e interrompe la funzione delle cellule muscolari, con conseguente paralisi.
Al microscopio, registra il numero di vermi vivi e paralizzati privi di movimento in base a stimoli meccanici. L'aumento del tasso di paralisi dei vermi suggerisce un declino della proteostasi associata all'età nel tessuto muscolare dei vermi.
Per misurare il declino della proteostasi nel tessuto muscolare, prelevare 20 animali e montarli su un vetrino da microscopio con un tampone di agarosio al 3% e una goccia da 5 microlitri di azoturo di sodio da 10 millimolari.
Dopo che tutti i vermi sono stati immobilizzati, riprendi l'intero corpo degli animali utilizzando una lente con ingrandimento 10x. Usa un filtro FITC o YFP e la stessa esposizione per ogni animale. Al termine, scartare le diapositive.
Conta il numero di focolai nei muscoli della parete corporea dell'intero animale. I fuochi sono segnali più luminosi e punteggiati che possono essere differenziati dal segnale solubile in meno nel dimmer
.Nei giorni di punteggio, guarda le targhe con gli animali e registra il numero di animali paralizzati. Quindi, rimuovi gli animali paralizzati dal piatto.
Al termine dell'esperimento, calcolare il tasso di paralisi per ciascuna condizione e tracciare la progressione della paralisi.