Saggio omogeneo di prossimità luminescente amplificato: un saggio di prossimità basato su perline per lo screening di piccole molecole che inibiscono le interazioni proteina-proteina

Nei sistemi biologici, la vicinanza di una proteina al suo partner specifico è un fattore determinante per il successo dell'interazione proteina-proteina. Con la presenza di piccole molecole inibitorie, queste proteine non possono avvicinarsi l'una all'altra, interrompendo le loro interazioni.

Per esaminare le molecole inibitorie per interrompere le interazioni tra due proteine - un chaperone e un co-chaperone - prendere una piastra multi-pozzetto contenente varie piccole molecole. Integra i pozzetti con perline donatrici con co-chaperoni attaccati alle loro superfici. Queste perle contengono fotosensibilizzanti per il saggio della chemiluminescenza.

Aggiungere un impasto di perle accettori coniugate alle sequenze peptidiche derivate dallo chaperone che si legano specificamente al co-chaperone. Le perle contengono un colorante a base di tiossino e fluorofori essenziali per la visualizzazione.

Nei pozzetti con molecole non inibitorie, elevate affinità tra i peptidi leganti chaperone e i co-chaperoni attraggono le perle accettore e donatrice. Mentre le perle rimangono distanti quando sono presenti inibitori.

Utilizzando un lettore a chemiluminescenza, studia l'interazione. Dopo l'illuminazione a una lunghezza d'onda specifica, i fotosensibilizzatori a microsfere donatrici emettono ossigeno singoletto altamente reattivo.

Senza molecole inibitorie, le specie emesse raggiungono le perle accettori situate prossimalmente e reagiscono con le molecole di colorante, causando la chemiluminescenza. Questa energia attiva i fluorofori delle perle accettori, provocando l'emissione di luce.

Al contrario, nei pozzetti con molecole inibitorie, gli ossigeni singoletto subiscono un decadimento, portando all'assenza di emissione di luce, indicando una riuscita inibizione delle interazioni proteina-proteina.

Aggiungere perline donatrici di glutatione a una concentrazione di 10 microgrammi per millilitro in PBS. Aggiungere GST-FKBP51 a una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro e incubare la reazione per 10 minuti a 25 gradi Celsius al buio.

Effettuare diluizioni seriali del composto in esame in DMSO. Aggiungere 0,25 microlitri di diluizioni del composto in prova in triplicato, nell'angolo di ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti.

Per il controllo negativo, aggiungere 0,25 microlitri di DMSO e per il controllo positivo, aggiungere 0,25 microlitri di peptide C-terminale Hsp90 nei pozzetti.

Aggiungere 22,5 microlitri della soluzione contenente perle donatrici di glutatione con proteine marcate GST in ciascun pozzetto. Agitare accuratamente la piastra con le mani e incubare al buio a 25 gradi Celsius per 15 minuti.

Diluire le perle accettori con il peptide C-terminale Hsp90 attaccato a una concentrazione di 100 microgrammi per millilitro in 0,5x PBS. Aggiungere 2,25 microlitri di perle accettori diluite in ogni pozzetto. Agitare e incubare la piastra al buio per 15 minuti come dimostrato.

Accendi lo strumento di lettura delle lastre, misura il segnale della lastra e analizza i dati come descritto nel manoscritto del testo.