JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 5:32 min • July 8th, 2025
Le cellule ospiti infettate da agenti patogeni microbici subiscono l'apoptosi, la morte cellulare programmata. Durante l'apoptosi, le DNasi degradano il DNA cromosomico in piccoli frammenti, portando alla morte cellulare.
Per rilevare l'apoptosi utilizzando il test TUNEL, prelevare un vetrino con una sezione di tessuto cutaneo deparaffinizzato e reidratato infettato da un patogeno fungino.
Trattare il tessuto con proteinasi-K per inattivare le DNasi cellulari, impedendo loro di degradare potenzialmente il DNA durante l'analisi. Aggiungere perossido di idrogeno per spegnere la reazione e lavare il vetrino per rimuovere la proteinasi-K non reagita.
Aggiungere un tampone contenente deossi-uridina trifosfato marcato con digoxigenina, o dUTP. Integrarlo con una deossinucleotidiltransferasi terminale, un enzima TdT e incubare. Nelle cellule apoptotiche, l'enzima TdT catalizza l'attaccamento di dUTP marcate ai gruppi 3'-ossidrilici esposti del DNA frammentato.
Successivamente, aggiungere un anticorpo anti-digossigenina coniugato a un reporter di rodamina e incubarlo al buio per facilitare il legame degli anticorpi alle dUTP marcate con digoxigenina, conferendo fluorescenza rossa all'imaging.
Trattare i campioni di tessuto con un colorante di contrasto nucleare fluorescente per visualizzare i nuclei. Posiziona un vetrino coprioggetti sulla sezione di tessuto e visualizzalo al microscopio a fluorescenza.
La fluorescenza blu aiuta a identificare i nuclei di tutte le cellule nella sezione tissutale, mentre la presenza di fluorescenza rossa nelle cellule colorate di rodamina indica la frammentazione del DNA dovuta all'apoptosi.
Per iniziare questa procedura, preparare vetrini idrofili con tessuto campione, come indicato nel protocollo di testo.
Per deparaffinare le sezioni di tessuto, lavare i vetrini tre volte con xilene, per 5 minuti ciascuno, in un barattolo di coplin. Successivamente, lavare i vetrini con etanolo al 100% due volte per 5 minuti ciascuno. Successivamente, lavare i vetrini con etanolo al 95% e etanolo al 70% per 3 minuti ciascuno, quindi lavare i vetrini una volta con PBS per 5 minuti.
Per preparare vetrini sperimentali e di controllo negativi, pretrattare il tessuto aggiungendo la proteinasi K appena diluita direttamente ai vetrini. Incubare i vetrini per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi lavare i vetrini in PBS due volte per 2 minuti ciascuno.
Per preparare i vetrini di controllo positivi, pretrattare il tessuto con tampone DN, quindi incubare i vetrini a temperatura ambiente per 5 minuti. Successivamente, sciogliere la DNasi I in tampone DN fino a una concentrazione finale di 0,1 microgrammi per millilitro. Aggiungere la soluzione di DNA preparata ai vetrini. Incubare i vetrini per 15 minuti a temperatura ambiente, quindi lavare i lati con acqua distillata in un barattolo di coplin cinque volte, per 3 minuti ciascuna.
Spegnere la reazione in perossido di idrogeno al 3% in PBS per 5 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare i vetrini in PBS due volte per due minuti ciascuno. Quindi, aggiungere un tampone di equilibrio al tessuto sui vetrini. Incubare per 10 secondi a temperatura ambiente, quindi picchiettare il liquido in eccesso attorno alla sezione di tessuto.
Diluire l'enzima deossinucleotidil transferasi terminale nel tampone di reazione, quindi aggiungerlo al tessuto sui vetrini di controllo sperimentali e positivi. Incubare in una camera umidificata per 1 ora a 37 gradi Celsius.
Successivamente, posizionare i vetrini in un barattolo di coplin contenente la concentrazione di lavoro del tampone di arresto. Agitare per 15 secondi, quindi incubare i vetrini a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi, lavare i vetrini con PBS tre volte per 1 minuto ciascuno e picchiettare il liquido in eccesso.
Successivamente, aggiungere il coniugato anti-digossigenina preriscaldato a temperatura ambiente direttamente sul tessuto. Incubare i vetrini per 30 minuti a temperatura ambiente in una camera buia umidificata.
Al termine dell'incubazione, lavare i vetrini con PBS quattro volte per due minuti ciascuno. Eliminare il liquido in eccesso. Quindi, aggiungere il mezzo di montaggio ai lati. Aggiungere 15 microlitri di soluzione DAPI al mezzo di montaggio sui vetrini. Coprire ogni vetrino con un vetrino coprioggetti e sigillare con smalto per unghie. Lasciare asciugare i vetrini al buio.
Utilizzando un microscopio a fluorescenza, osservare i vetrini immediatamente dopo il completamento del processo di colorazione.
Scatta foto 400 volte a intervalli casuali lungo ogni sezione della pelle. Conta le cellule blu colorate con DAPI per assicurarti che siano visibili almeno 100 cellule per sezione di pelle, per animale. Quindi, conta il numero di celle TUNEL-positive che appaiono come singole celle rosse con bordi chiari.