Marcatura terminale di dUTP Nick mediata dalla transferasi terminale: saggio TUNEL: un metodo in situ per rilevare la frammentazione del DNA nelle cellule apoptotiche

Le cellule ospiti infettate da agenti patogeni microbici subiscono l'apoptosi, la morte cellulare programmata. Durante l'apoptosi, le DNasi degradano il DNA cromosomico in piccoli frammenti, portando alla morte cellulare.

Per rilevare l'apoptosi utilizzando il test TUNEL, prelevare un vetrino con una sezione di tessuto cutaneo deparaffinizzato e reidratato infettato da un patogeno fungino.

Trattare il tessuto con proteinasi-K per inattivare le DNasi cellulari, impedendo loro di degradare potenzialmente il DNA durante l'analisi. Aggiungere perossido di idrogeno per spegnere la reazione e lavare il vetrino per rimuovere la proteinasi-K non reagita.

Aggiungere un tampone contenente deossi-uridina trifosfato marcato con digoxigenina, o dUTP. Integrarlo con una deossinucleotidiltransferasi terminale, un enzima TdT e incubare. Nelle cellule apoptotiche, l'enzima TdT catalizza l'attaccamento di dUTP marcate ai gruppi 3'-ossidrilici esposti del DNA frammentato.

Successivamente, aggiungere un anticorpo anti-digossigenina coniugato a un reporter di rodamina e incubarlo al buio per facilitare il legame degli anticorpi alle dUTP marcate con digoxigenina, conferendo fluorescenza rossa all'imagi