JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 2:54 min • July 8th, 2025
La caspasi-3 e la caspasi-7 sono proteasi che riconoscono la sequenza tetrapeptidica DEVD nelle proteine bersaglio, scindendole al C-terminale del residuo di acido aspartico. Questi svolgono un ruolo di primo piano nella cascata dell'apoptosi, la morte cellulare programmata.
Per valutare l'attività della caspasi-3/7 nelle cellule apoptotiche, iniziare con un tubo contenente un espiante di pelle di dito di rana infettato da funghi che inducono l'apoptosi. Aggiungere un tampone adatto al tubo e alcune perline metalliche.
Usa il bead-beating per distruggere le cellule della pelle e rilasciare il contenuto cellulare, comprese le proteine della caspasi-3/7. Centrifugare la provetta, i detriti delle cellule di pellettatura e gli organelli. Aspirare il surnatante ricco di proteine dalla provetta e pipettarlo nei pozzetti di una piastra di analisi multipozzetto.
Integrare i pozzetti con il reagente caspasi luminogenica. Questo reagente è costituito da un substrato proluminescente contenente il peptide DEVD in una soluzione tamponata contenente ATP, ioni magnesio e enzima luciferasi.
Mescolare il contenuto del pozzetto e incubare. Durante l'incubazione, la caspasi-3/7 scinde il substrato proluminescente, rilasciando aminoluciferina - un substrato per la luciferasi - nella soluzione.
In presenza di ATP e ioni magnesio, la luciferasi ossida l'aminoluciferina rilasciata, generando un prodotto bioluminescente. La quantità di luce prodotta durante la reazione è proporzionale all'attività della caspasi.
Per estrarre le proteine da un campione congelato di punta di rana, posizionare il campione in una provetta da microcentrifuga con tappo a vite da 1,5 millilitri, contenente 100 microlitri di tampone per campioni e due perle di acciaio inossidabile.
Utilizzare un frusta per perline alla massima velocità per lisare le cellule. Successivamente, posizionare la provetta sul ghiaccio per 3 minuti, quindi centrifugare la provetta per raccogliere il surnatante.
Per eseguire il saggio della caspasi 3/7 in una piastra a 384 pozzetti, aggiungere 10 microlitri di tampone campione in bianco e 10 microlitri di estratto proteico in triplicato. Quindi, pipettare 10 microlitri di reagente caspasi 3/7 disponibile in commercio nell'estratto proteico e nei pozzetti in bianco. Quindi, agitare delicatamente la piastra per 15 secondi per mescolare i due reagenti.
Incubare a temperatura ambiente e al buio per 30 minuti. Infine, utilizzare un lettore di piastre luminescenti per misurare la luminescenza del campione.