JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 2:54 min. • July 8th, 2025
La caspasi-3 e la caspasi-7 sono proteasi che riconoscono la sequenza tetrapeptidica DEVD nelle proteine bersaglio, scindendole al C-terminale del residuo di acido aspartico. Questi svolgono un ruolo di primo piano nella cascata dell'apoptosi, la morte cellulare programmata.
Per valutare l'attività della caspasi-3/7 nelle cellule apoptotiche, iniziare con un tubo contenente un espiante di pelle di dito di rana infettato da funghi che inducono l'apoptosi. Aggiungere un tampone adatto al tubo e alcune perline metalliche.
Usa il bead-beating per distruggere le cellule della pelle e rilasciare il contenuto cellulare, comprese le proteine della caspasi-3/7. Centrifugare la provetta, i detriti delle cellule di pellettatura e gli organelli. Aspirare il surnatante ricco di proteine dalla provetta e pipettarlo nei pozzetti di una piastra di analisi multipozzetto.
Integrare i pozzetti con il reagente caspasi luminogenica. Questo reagente è costituito da un substrato proluminescente contenente il peptide DEVD in una soluzione tamponata contenente ATP, ioni magnesio e enzima luciferasi.
Mescolare il contenuto del pozzetto e incubare. Durante l'incubazione, la caspasi-3/7 scinde il substrato pr
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