Saggio di efferocitosi cellulare fissa: un metodo per studiare l'assorbimento efferocitico delle cellule apoptotiche da parte dei macrofagi utilizzando la microscopia a fluorescenza

Le cellule sottoposte ad apoptosi - morte cellulare programmata - mostrano segnali eat-me sulla loro superficie cellulare, facilitando la degradazione da parte dei fagociti - cellule immunitarie specializzate. Questo processo di eliminazione delle cellule apoptotiche è chiamato efferocitosi.

Per eseguire il test di efferocitosi, prelevare innanzitutto una sospensione di cellule apoptotiche a doppia colorazione. Le superfici di queste cellule sono marcate con biotina e il citoplasma è marcato con un colorante per il tracciamento delle cellule, che identifica i materiali derivati dalle cellule apoptotiche.

Aggiungere la sospensione cellulare in una coltura di cellule macrofagiche aderenti, che funzionano come efferociti. Centrifugare, forzando il contatto tra macrofagi e cellule apoptotiche, e incubare.

I recettori efferocitici sui macrofagi si legano alla fosfatidilserina - un segnale mangia-me - sulla membrana cellulare apoptotica, facilitandone l'inghiottimento. Piccoli frammenti della cellula apoptotica vengono assorbiti all'interno di una vescicola legata alla membrana, chiamata efferosoma.

Ciò si traduce in una frazione efferocitata - parte della cellula apoptotica all'interno del macrofago - e in una frazione non efferocitata - la parte non internalizzata della cellula apoptotica.

Aggiungere streptavidina marcata in fluorescenza, che si lega alle molecole di biotina esposte sulla superficie della frazione non efferocitata, differenziando le porzioni non internalizzate e internalizzate della cellula apoptotica.

Al microscopio a fluorescenza, la frazione cellulare apoptotica non internalizzata mostra l'etichettatura della streptavidina, mentre gli efferosomi appaiono come punti discreti privi di streptavidina.

Per quantificare l'efferocitosi, determinare il numero di efferosomi discreti e misurare l'intensità delle frazioni cellulari apoptotiche efferocitate e non efferocitate.

Dopo aver preparato i macrofagi umani e le cellule Jurkat apoptotiche, utilizzare un emocitometro per contare le cellule apoptotiche. Quindi, trasferire una quantità sufficiente di cellule apoptotiche in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Pellettare le celle Jurkat mediante centrifugazione a 500 volte g per 5 minuti. Quindi, risospendere le cellule in 500 microlitri di PBS. Mentre le cellule Jurkat sono nella centrifuga, aliquotare 10 microlitri di DMSO in una nuova provetta per microcentrifuga.

Successivamente, sciogliere una quantità minima di NHS-biotina nel DMSO. Successivamente, trasferire 500 microlitri della cellula apoptotica e della sospensione PBS nella provetta contenente DMSO e NHS-biotina. Quindi, diluire un colorante appropriato per il tracciamento delle cellule secondo le istruzioni del produttore.

Incubare la sospensione cellulare a temperatura ambiente per 20 minuti al buio. Quindi, aggiungere un volume uguale di RPMI 1640 con il 10% di FBS e incubare la sospensione a temperatura ambiente al buio per altri 5 minuti.

Successivamente, pellettare le celle tramite centrifugazione a 500 volte g per 5 minuti. Quindi, scartare il surnatante e risospendere le cellule colorate in 100 microlitri di RPMI 1640 con il 10% di FBS. Aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare colorata goccia a goccia in ciascun pozzetto di macrofagi. Quindi, centrifugare la piastra a 200 volte g per 1 minuto. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di CO₂ in un incubatore per colture tissutali.

Dopo l'adeguato periodo di incubazione, rimuovere le cellule dall'incubatrice. Quindi, lavare le cellule due volte con 1 millilitro di PBS. Successivamente, aggiungere la streptavidina diluita coniugata con FITC a ciascun pozzetto e incubare la piastra per 20 minuti al buio.

Lavare le cellule tre volte con 1 millilitro di PBS e agitare delicatamente i campioni per 5 minuti dopo ogni risciacquo. Quindi, fissare le cellule con paraformaldeide al 4% in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente. Sciacquare le celle una volta con PBS per rimuovere l'eccesso di PFA.

Montare i vetrini coprioggetti su un vetrino per immagini e trasferire il vetrino su un microscopio a fluorescenza. Cattura z-stack di un numero sufficiente di celle per la quantificazione.