JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 7:16 min • July 8th, 2025
Gli ovociti nella profase-I della meiosi sono attivi trascrizionalmente; producono mRNA e li immagazzinano in una forma dormiente. Durante la maturazione, quando l'ovocita entra in metafase, gli mRNA immagazzinati vengono tradotti in proteine.
Per studiare la traduzione dell'mRNA, iniziare con ovociti di topo arrestati con profase I sospesi in una goccia di terreno. Posizionare la pipetta di supporto vicino a un singolo ovocita per tenerlo in posizione.
Prenda una pipetta per microiniezione contenente una miscela reporter. Questo mix contiene due tipi distinti di mRNA, uno che codifica per la proteina fluorescente gialla, o YFP - un reporter fuso con la regione 3'-non tradotta del gene bersaglio - e un mRNA poliadenilato che codifica per la proteina fluorescente rossa.
Iniettare la miscela reporter nell'ovocita. Incubare gli ovociti microiniettati in un terreno di maturazione integrato con cilostamide, un inibitore chimico che mantiene l'arresto della profase-I.
L'ovocita traduce l'mRNA poliadenilato fino a quando l'intensità della fluorescenza rossa raggiunge un plateau, mentre i livelli di mRNA codificante YFP privi di una coda di poliadenilazione rimangono tali.
Trasferire gli ovociti trattati in un terreno di maturazione senza cilostamide, che aiuta a riprendere la meiosi; e l'mRNA bersaglio subisce la traduzione per produrre la proteina bersaglio fusa con un reporter fluorescente giallo.
Esegui l'imaging time-lapse per visualizzare i segnali di fluorescenza a intervalli regolari.
Gli ovociti iniettati mostrano livelli costanti di fluorescenza rossa, mentre la fluorescenza gialla aumenta nel tempo, indicando la traduzione e l'accumulo graduale delle proteine reporter.
Per iniziare, apri con cura i follicoli antrali praticando un piccolo taglio nella parete del follicolo con un ago calibro 26. Isolare i COC intatti con diversi strati di cellule cumuliformi utilizzando una pipetta di vetro azionata a bocca. Utilizzare una pipetta più piccola e denudare meccanicamente i COC mediante pipettaggio ripetuto.
Aspirare gli ovociti denudati e metterli in una capsula di Petri con terreno di maturazione integrato con 1 micromolare di cilostamide. Porre la capsula in un'incubatrice per due ore, per permettere agli ovociti di riprendersi dallo stress indotto dal loro isolamento dai follicoli.
Posizionare un tubo capillare in vetro borosilicato lungo 10 centimetri e un estrattore meccanico per preparare gli aghi per iniezione. Piegare la punta dell'ago con un angolo di 45 gradi utilizzando un filamento riscaldato per un'iniezione ottimale. Mettere 20 microlitri di terreno basico per la raccolta degli ovociti in una capsula di polistirene e coprire le goccioline con olio minerale leggero.
Preparare un volume maggiore di miscela reporter aggiungendo 12,5 microgrammi per microlitro di Ypet UTR e mCherry ciascuno. Conserva aliquote di questi a meno 80 gradi Celsius. Dopo lo scongelamento, centrifugare l'aliquota per due minuti a 20.000 x g. Quindi, trasferirla in una nuova provetta da microcentrifuga.
Caricare l'ago per iniezione con circa 0,5 microlitri di miscela reporter. Posizionare la pipetta di tenuta e l'ago per iniezione nei supporti e posizionarli nella gocciolina del terreno di raccolta degli ovociti.
Aprire l'ago per iniezione picchiettandolo delicatamente contro la pipetta di contenimento. Mettere gli ovociti in una gocciolina di terreno di raccolta basico e iniettare da 5 a 10 picolitri della miscela reporter. Incubare gli ovociti nel terreno di maturazione con 1 cilostamide micromolare per 16 ore per consentire al segnale mCherry di stabilizzarsi.
Per la microscopia time-lapse, preparare una piastra di Petri con due goccioline da 20 microlitri di terreno di maturazione per ogni reporter iniettato. Una gocciolina con 1 cilostamide micromolare per gli ovociti arrestati con profase I di controllo e una gocciolina senza cilostamide per gli ovociti in maturazione. Coprire le goccioline con olio minerale leggero e metterle nell'incubatrice.
Dopo la pre-incubazione, rimuovere gli ovociti iniettati dall'incubatrice e lavarli quattro volte in terreno di maturazione senza cilostamide. Mantenere alcuni ovociti nel terreno di maturazione con 1 cilostamide micromolare come gruppo di controllo degli ovociti profase-I.
Trasferire gli ovociti iniettati nelle rispettive goccioline sul piatto del microscopio time-lapse precedentemente preparato. Raggruppare gli ovociti con una pipetta di vetro chiusa per impedirne il movimento durante la registrazione.
Posizionare la capsula sotto il microscopio dotato di un sistema di illuminazione a diodi emettitori di luce e di un tavolino motorizzato dotato di una camera ambientale mantenuta a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica, utilizzando i parametri menzionati nel manoscritto del testo.
Inserisci le impostazioni appropriate per l'esperimento time-lapse facendo clic su "App" e poi su "Acquisizione multidimensionale". Seleziona la prima scheda "Principale" e seleziona "Time-lapse", "Posizioni multiple del palco" e "Lunghezze d'onda multiple".
Seleziona la scheda "Salvataggio" per inserire la posizione in cui deve essere salvato l'esperimento. Quindi, seleziona la scheda "Time-lapse" per inserire il numero di punti temporali, la durata e l'intervallo di tempo. Seleziona la scheda "Stage". Attiva il campo chiaro e individua la posizione degli ovociti aprendo una nuova finestra e selezionando "Acquisisci", "Acquisisci" e "Mostra in diretta".
Una volta individuati gli ovociti, torna alla "Finestra di acquisizione multidimensionale " e premi "+" per impostare la posizione degli ovociti. Seleziona la scheda "Lunghezze d'onda" e imposta tre diverse lunghezze d'onda per campo chiaro, YFP e mCherry. Regolare l'esposizione per Ypet e mCherry. Quindi, avvia l'esperimento time-lapse facendo clic su "Acquisisci".
Per l'analisi della traduzione UTR di Ypet-3', eseguire due misurazioni della regione per ciascun ovocita. L'ovocita stesso agganciando la "regione ellisse" e una piccola regione che circonda l'ovocita da utilizzare per la sottrazione dello sfondo facendo clic su "Regione rettangolare". Esporta i dati di misurazione della regione in un foglio di calcolo facendo clic su "Apri registro" e quindi su "Registra dati".
Per ogni singolo ovocita e per tutti i punti temporali misurati, sottrarre la misurazione della regione di fondo dalla misurazione della regione dell'ovocita separatamente per le lunghezze d'onda YFP e mCherry.