JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:01 min. • July 8th, 2025
Il film lacrimale, il fluido protettivo che ricopre l'occhio, aiuta a lubrificare e mantenere le cellule epiteliali corneali oculari, CEC, in uno stato sano e metabolicamente attivo. Un film lacrimale compromesso, come nella malattia dell'occhio secco, può causare l'evaporazione lacrimale dalle CEC, aumentando la loro suscettibilità alle infezioni e ai danni infiammatori.
Le formulazioni lacrimali artificiali stabilizzano il film lacrimale e migliorano la ritenzione idrica, prevenendo la disidratazione cellulare.
Per esaminare gli effetti citotossici di una formulazione di lacrime artificiali di prova sulle CEC utilizzando il saggio alamarBlue, iniziare con una coltura aderente di CEC di derivazione umana in terreni adatti. Eliminare il supporto.
Incubare la coltura cellulare con una concentrazione specifica della formulazione di lacrime artificiali. La formulazione lacrimale forma un rivestimento sulle cellule. A seconda dell'effetto cumulativo degli ingredienti costituenti, le cellule possono subire una perdita di attività metabolica.
Successivamente, aggiungere la soluzione alamarBlue contenente resazurina, un colorante di colore blu, debolmente fluorescente, non tossico e solubile in acqua.
La resazurina si diffonde nelle cellule e viene ridotta irreversibilmente nelle cellule metabolicamente attive principalmente dalle reduttasi mitocondriali poiché accetta elettroni dai donatori di elettroni dei processi metabolici della respirazione, formando una resorufina di colore rosa, altamente fluorescente, che si muove liberamente dalle cellule nella soluzione. Trasferire la soluzione contenente resorufina in una piastra multipozzetto nuova.
Utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza, misurare l'intensità della fluorescenza. Un basso valore di intensità della fluorescenza indica una bassa attività metabolica cellulare, suggerendo effetti indesiderati della formulazione lacrimale sulle CEC.
Rimuovere i terreni di coltura dai pozzetti e trattare immediatamente le cellule con 150 microlitri di una formulazione di prova o di una soluzione di controllo dei terreni. Quindi, incubare le cellule per 30 minuti.
Rimuovere la soluzione di prova dalle cellule e aggiungere 0,5 millilitri di soluzione colorante metabolica al 10%. Incubare le cellule per altre quattro ore.
Dopo l'incubazione, rimuovere 100 microlitri di soluzione colorante da ciascun pozzetto e trasferirlo in una piastra a 96 pozzetti. Utilizzare un lettore di piastre per misurare la fluorescenza di ciascun pozzetto, impostando l'eccitazione a 540 nanometri e l'emissione a 590 nanometri.