JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:21 min. • July 8th, 2025
L'intestino medio dell'insetto contiene una regione cellulare di rame - CCR - che è responsabile dell'acidificazione intestinale. Questa regione contiene cellule secretorie specializzate - cellule di rame - che producono acido, che passa attraverso lo stretto canale formato dalle cellule interstiziali vicine. L'acido viene rilasciato nel lume intestinale per aiutare la digestione.
Per monitorare l'acidificazione intestinale in Drosophila, assumere mosche adulte affamate per una durata adeguata. Metti le mosche in una piastra di Petri contenente una singola goccia di cibo per mosche integrato con blu di bromofenolo, o BPB, un colorante indicatore di pH. Lascia che le mosche affamate si nutrano per un periodo fisso.
Dopo l'ingestione del cibo, l'acido prodotto dalle cellule di rame raggiunge il lume intestinale e si mescola con il cibo contenente BPB. A pH acido, le molecole di BPB vengono protonate, il che cambia il loro colore da blu a giallo, indicando acidificazione.
Al termine della durata dell'esperimento, posizionare la piastra di Petri sul ghiaccio. Una bassa temperatura cessa l'attività neuromuscolare nei moscerini e li anestetizza. Metti una singola mosca sotto uno stereomicroscopio e isola chirurgicamente il tratto digestivo intatto.
Esaminare il colore CCR per determinare lo stato dell'acidificazione intestinale. Una colorazione gialla indica l'acidificazione, mentre una colorazione blu indica l'assenza di acidificazione.
Ispeziona il tratto digestivo di tutte le mosche e calcola la percentuale di individui che mostrano acidificazione intestinale.
Iniziare a organizzare il test di monitoraggio dell'acidificazione intestinale con la preparazione del cibo per mosche con blu di bromofenolo sensibile al pH o colorante BPB. Per fare ciò, sciogliere il cibo per mosche in un forno a microonde e lasciarlo raffreddare fino a quando non sarà tiepido. Aggiungere 1 millilitro di BPB al 4% a 1 millilitro di cibo tiepido con un pozzetto di miscelazione. Usando una pipetta, aggiungi il cibo per mosche contenente BPB in un singolo punto di circa 200 microlitri al centro di una capsula di Petri.
Successivamente, raccogli le mosche Drosophila melanogaster femmine non vergini di 0-2 giorni e lascia che le mosche si riprendano con il cibo standard a base di farina di mais. Prima dell'esperimento, far morire di fame le mosche per 24 ore a temperatura ambiente in una fiala contenente un fazzoletto da laboratorio imbevuto di circa 2 millilitri di acqua deionizzata.
Trasferisci le mosche affamate in una capsula di Petri contenente singoli punti di cibo per mosche appena preparato integrato con il 2% di BPB per consentire alle mosche di foraggiare per quattro ore a temperatura ambiente, mentre sono esposte alla luce.
Dopo quattro ore, raccogli le mosche. Quindi, procedere all'isolamento chirurgico delle mosche anestetizzate in 1x PBS con una pinza sotto uno stereomicroscopio. Conta il numero di moscerini che mostrano una robusta colorazione BPB nelle viscere e calcola la percentuale usando l'equazione.