Saggio delle proteine solubili per quantificare il contenuto di proteine solubili nei tessuti vegetali

Per quantificare il contenuto di proteine solubili in un tessuto vegetale, in una provetta, iniziare con una quantità appropriata di tessuto vegetale liofilizzato macinato.

Aggiungere idrossido di sodio, un alcali, al tubo e sonicare. L'ambiente alcalino con le forze meccaniche disgrega le cellule, rilasciando contenuti intracellulari, comprese le macromolecole - proteine solubili e carboidrati. Incubare a temperature più elevate.

In presenza di calore, gli alcali causano l'idrolisi delle proteine, formando peptidi più piccoli e aumentando la solubilità delle proteine. Inoltre, i carboidrati vengono degradati.

Centrifugare il composto. Raccogliere il surnatante contenente proteine solubilizzate. Aggiungere acido cloridrico per neutralizzare il pH.

Trattare il campione con acido tricloroacetico, TCA. Il TCA distrugge l'involucro di idratazione che circonda le proteine, portando all'aggregazione e alla precipitazione delle proteine.

Centrifugare e rimuovere il surnatante contenente TCA. Lavare il pellet proteico con acetone ghiacciato per rimuovere eventuali residui di TCA, che potrebbero interferire con la stima delle proteine solubili.

Asciugare l'acetone all'aria. Risospendere il pellet proteico in idrossido di sodio. Diluire con acqua deionizzata. Trasferire nei pozzetti di una piastra a più pozzetti.

Aggiungere una soluzione acida di colorante Coomassie Brilliant Blue G-250. In condizioni acide, il colorante si lega ai residui di amminoacidi basici nelle proteine solubilizzate, dando luogo a un complesso proteina-colorante blu.

Utilizzare uno spettrofotometro per misurare l'assorbanza del complesso proteina-colorante, proporzionale al contenuto proteico solubile nel tessuto vegetale.

Per iniziare, pesare campioni replicati di ciascun tessuto in provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri etichettate. Quindi, registra la massa precisa di ciascun campione. Utilizzando un micropipettatore, aggiungere 500 microlitri di idrossido di sodio molare 0,1 a ciascuna provetta. Chiudere bene i coperchi e sonicare i tubi per 30 minuti.

Quindi, immergere i tubi in un bagno di acqua calda preriscaldato per 15 minuti. Successivamente, centrifugare le provette a 15.000 g per 10 minuti. Pipettare il surnatante in nuove provette per microcentrifuga etichettate utilizzando un nuovo puntale per pipetta per ogni campione.

Aggiungere 300 microlitri di idrossido di sodio molare 0,1 al pellet e ripetere la centrifugazione per 10 minuti. Successivamente, rimuovere il surnatante e trasferirlo nelle provette contenenti il surnatante della prima centrifugazione.

Per neutralizzare il pH del surnatante, aggiungere 11 microlitri di acido cloridrico molare 5,8 molare. Usa la cartina di tornasole per confermare che il pH è di circa 7.

Quindi, aggiungi 90 microlitri di acido tricloroacetico al 100% in ogni tubo. Quindi, incubare le provette con ghiaccio per 30 minuti. Centrifugare i campioni a 13.000 g per 10 minuti a 4 gradi Celsius. Con cautela, utilizzare una linea per il vuoto e una punta per micropipetta in vetro per rimuovere l'acido tricloroacetico.

Fare molta attenzione a non disturbare il pellet con la punta di aspirazione.

Successivamente, lavare il pellet con 100 microlitri di acetone raffreddato a meno 20 gradi Celsius. Quindi, lasciare evaporare l'acetone in una cappa aspirante. Sciogliere il pellet proteico con 1 millilitro di idrossido di sodio. Potrebbero essere necessari ulteriori cicli di riscaldamento, vortice e sonicazione.

Aggiungere 160 microlitri di ciascuna soluzione standard di IgG a una piastra a 96 pozzetti in triplice copia, iniziando dalla posizione A1. Successivamente, in una nuova provetta da 1,5 millilitri, aggiungere 50 microlitri di ciascuna soluzione campione a 950 microlitri di acqua distillata. Quindi, aggiungere 60 microlitri di ciascun campione diluito alla piastra a pozzetti in triplice copia, iniziando dalla posizione H1. Aggiungere 100 microlitri di acqua distillata a tutti i pozzetti del campione vuoti e sconosciuti.

Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 40 microlitri di colorante proteico Coomassie brilliant blue G-250 a ciascun pozzetto della piastra. Usando un ago, fai scoppiare le bolle presenti nei pozzetti. Successivamente, lasciare incubare la piastra a temperatura ambiente per 5 minuti. Quindi, utilizzare uno spettrofotometro per micropiastre per registrare i valori di assorbanza per ciascun pozzetto a 595 nanometri.