JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:34 min • July 8th, 2025
Il Toxoplasma gondii - un protozoo unicellulare - è un parassita anaerobio obbligato, che si riproduce solo all'interno delle cellule ospiti.
Per quantificare la crescita intracellulare del parassita utilizzando un test basato sulla luciferasi, prendere una sospensione di cellule del parassita che esprimono luciferasi, un enzima che produce luminescenza dopo reazione con il suo substrato. Aggiungere la sospensione a una coltura di fibroblasti del prepuzio umano e incubare per una durata adeguata.
Il parassita si lega ai recettori delle cellule ospiti e viene internalizzato attraverso un processo endocitico, formando un vacuolo parassitoforo. La struttura fornisce una nicchia per la riproduzione del parassita.
Dopo l'infezione, aspirare il terreno, rimuovendo i parassiti non internalizzati. Aggiungere un tampone di lisi contenente un detergente e luciferina, un substrato per la luciferasi. Il detergente nel tampone crea pori nella membrana cellulare e lisa completamente le cellule, con conseguente rilascio di luciferasi.
L'enzima rilasciato ossida le molecole di luciferina, emettendo luce. Misurare l'intensità della luminescenza per determinare l'attività della luciferasi. Utilizzando pozzetti replicati contenenti cellule ospiti infette, misurare l'attività della luciferasi a intervalli predeterminati dopo l'infezione.
Tracciare l'intensità della luminescenza normalizzata rispetto agli intervalli di tempo per ottenere le variazioni di piegatura nella crescita del parassita nel tempo. Un aumento temporale dell'intensità indica il successo della moltiplicazione del parassita.
Traccia i valori in scala logaritmica per calcolare la pendenza della curva, che rappresenta il tempo di raddoppio del parassita.
Per eseguire un saggio di crescita del Toxoplasma a base di luciferasi, iniziare aspirando attentamente il terreno da colture di micropiastre pre-seminate a 96 pozzetti di fibroblasti del prepuzio umano e inoculare 150 microlitri di sospensione priva di parassiti nei pozzetti in un formato a tre colonne e cinque file.
Dopo un'incubazione di quattro ore nell'incubatore per colture cellulari, aspirare con cura il terreno da ciascun pozzetto per rimuovere i parassiti non invasi e riempire i pozzetti in ciascuno di essi, tranne la prima fila, con terreno privo di rosso fenolo a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere 100 microlitri di una soluzione di substrato di luciferasi 12,5 micromolare in PBS in ciascun pozzetto della fila superiore e incubare le micropiastre per 10 minuti a temperatura ambiente per consentire la lisi cellulare completa.
Al termine dell'incubazione, misurare l'attività della luciferasi su un lettore di micropiastre. Ogni lettura rappresenta il numero iniziale di parassiti invasi quattro ore dopo l'infezione. Ripetere l'analisi ogni 24 ore per i successivi quattro giorni senza cambiare il mezzo.
Per calcolare il cambiamento di piega normalizzato della crescita del parassita, ogni lettura può essere divisa per la lettura iniziale a quattro ore dopo l'infezione. Il log2 del cambiamento di piega normalizzato della crescita del parassita può quindi essere tracciato rispetto a ciascun punto temporale e sottoposto a una funzione di regressione lineare per ottenere la pendenza, che rappresenta il tempo di raddoppio.