Saggio di estrazione Msp1 per studiare la rimozione di proteine TA mal localizzate

Msp1, un'ATPasi nella membrana esterna mitocondriale, rimuove le proteine ancorate alla coda mal localizzate, o TA, dalla membrana attraverso il suo poro centrale esamerico, facilitandone la degradazione.

Comprendere il meccanismo di traslocazione, co-ricostituire le proteine TA e Msp1 in liposomi, consentendo la loro integrazione nel doppio strato lipidico.

Preparare una miscela di reazione aggiungendo i liposomi ricostituiti a un tampone adatto contenente chaperoni, ovvero proteine citosoliche di controllo della qualità. Gli chaperoni sono marcati con l'enzima glutatione-S-transferasi o GST.

Aggiungere adenosina trifosfato (ATP) alla reazione. La Msp1 si lega alle molecole di ATP e le idrolizza. Utilizzando l'energia generata dall'idrolisi, Msp1 trasloca le proteine TA legate alla membrana attraverso il suo poro centrale. Gli chaperoni nella miscela di reazione si legano al dominio transmembrana delle proteine TA estratte.

Quindi, caricare la miscela di reazione su una colonna di purificazione per affinità. La colonna contiene una resina coniugata con glutatione ridotto o GSH. La proteina GST sugli chaperoni si lega al GSH coniugato - il suo substrato - attaccando i complessi pro