JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 4:57 min • July 8th, 2025
Nel pesce zebra, il particolato fine ambientale, o PM, un inquinante atmosferico, provoca un malfunzionamento cardiaco indotto dallo stress ossidativo.
Per studiare l'impatto del PM sul pesce zebra, iniziare esponendo gli embrioni di pesce zebra alla materia organica estraibile derivata dal PM, EOM, che innesca la generazione di specie reattive dell'ossigeno, o ROS.
I ROS ossidano la guanina base del DNA a 8-idrossi-2′-deossiguanosina o 8-OHdG e provocano la fosforilazione dell'istone H2AX per formare γH2AX, un marcatore per le rotture del doppio filamento del DNA.
Dopo l'esposizione, sezionare il cuore del pesce zebra e posizionarlo su un vetrino. Trattare il cuore con una soluzione fissativa che lega le proteine, stabilizzando la struttura cellulare.
Successivamente, aggiungere un reagente bloccante per evitare siti di legame non specifici. Aggiungere anticorpi primari che hanno come bersaglio γH2AX e 8-OHdG nelle cellule cardiache.
Successivamente, aggiungere due anticorpi secondari marcati con fluorescenza di colore diverso che si legano specificamente alla regione Fc del rispettivo anticorpo primario. Infine, colorare il campione con DAPI – un colorante specifico del DNA – che si lega al solco minore delle sequenze ricche di AT nel DNA per formare un complesso fluorescente.
Posizionare il vetrino sotto un microscopio a fluorescenza per osservare i segnali dell'espressione di 8-OHdG e γH2AX nel cuore degli embrioni di zebrafish trattati con EOM.
Un'intensità di fluorescenza significativamente elevata dalle cellule cardiache indica un danno ossidativo al DNA indotto da EOM e rotture a doppio filamento.
Usa una penna barriera idrofobica per disegnare un cerchio su un vetrino pulito. Aggiungere 50 microlitri di paraformaldeide al 4% a 1,25 microlitri di PBS per ottenere una soluzione fissativa. Quindi, posizionare tre cuori sezionati in un cerchio di barriera idrofobica e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
Decantare la soluzione al microscopio e asciugare i campioni a temperatura ambiente per almeno 5 minuti. Lavare i vetrini tre volte in PBST, per 5 minuti per lavaggio. Aggiungere 50 microlitri di BSA a 1.000 microlitri di PBST per ottenere una soluzione al 5% di BSA e incubare i vetrini in una camera umida per 1 ora per bloccare il legame degli anticorpi non specifici.
Decantare la soluzione e lavare i campioni tre volte con PBS per 5 minuti per lavaggio. Diluire due microlitri di anticorpo monoclonale di topo contro l'8-idrossi-deossiguanosina e due microlitri di anticorpo policlonale di coniglio contro gamma-H2AX in 296 microlitri di PBST, per ottenere una soluzione di cocktail di anticorpi primari funzionante.
Incubare i campioni di cuore con 50 microlitri della soluzione di cocktail di anticorpi primari, in una camera umidificata per almeno 1 ora a temperatura ambiente o durante la notte a 4 gradi Celsius.
Decantare la soluzione e lavare i campioni tre volte con PBST per 5 minuti per lavaggio. Diluire 1 microlitro di anticorpo secondario anti-topo di capra marcato con FITC e 1 microlitro di anticorpo secondario anti-coniglio di capra cy3 in 500 microlitri di PBST per ottenere una soluzione di cocktail di anticorpi secondari funzionante.
Incubare i campioni con gli anticorpi secondari per 1 ora a temperatura ambiente al buio.
Decantare la soluzione e lavare i campioni tre volte con PBS per 5 minuti per lavaggio. Aggiungere 20 microlitri di DAPI ai campioni per la colorazione nucleare e incubarli per 30 minuti a temperatura ambiente. Applicare un vetrino coprioggetti sul vetrino e sigillarlo con smalto per evitare l'essiccazione e il movimento.
Visualizzare i campioni al microscopio a fluorescenza e quantificare il segnale fluorescente dell'area cardiaca utilizzando il software ImageJ. Calcolare le variazioni relative utilizzando la media dei campioni di controllo DMSO e determinare la significatività statistica dei dati.