Saggio di immunofluorescenza per rilevare il danno al DNA mediato da PM_2,5 negli embrioni di pesce

Nel pesce zebra, il particolato fine ambientale, o PM, un inquinante atmosferico, provoca un malfunzionamento cardiaco indotto dallo stress ossidativo.

Per studiare l'impatto del PM sul pesce zebra, iniziare esponendo gli embrioni di pesce zebra alla materia organica estraibile derivata dal PM, EOM, che innesca la generazione di specie reattive dell'ossigeno, o ROS.

I ROS ossidano la guanina base del DNA a 8-idrossi-2′-deossiguanosina o 8-OHdG e provocano la fosforilazione dell'istone H2AX per formare γH2AX, un marcatore per le rotture del doppio filamento del DNA.

Dopo l'esposizione, sezionare il cuore del pesce zebra e posizionarlo su un vetrino. Trattare il cuore con una soluzione fissativa che lega le proteine, stabilizzando la struttura cellulare.

Successivamente, aggiungere un reagente bloccante per evitare siti di legame non specifici. Aggiungere anticorpi primari che hanno come bersaglio γH2AX e 8-OHdG nelle cellule cardiache.

Successivamente, aggiungere due anticorpi secondari marcati con fluorescenza di colore diverso che si legano specificamente alla regione Fc del rispettivo anticorpo primario. Infine, colorare il campione con DAPI – un colorante specifico del DNA – che