Saggio della ferita per valutare la capacità migratoria dei mioblasti murini in co-coltura

In risposta a una ferita, le cellule secretorie producono molecole di segnalazione paracrina per attivare i mioblasti, le cellule muscolari indifferenziate. I mioblasti attivati migrano verso il sito della ferita, dove proliferano, provocando la guarigione della ferita.

Per valutare la capacità migratoria dei mioblasti in vitro, prelevare una piastra multipozzetto contenente un monostrato confluente di mioblasti murini. Utilizzando la punta di una pipetta, grattare il monostrato per creare un cerotto lineare e privo di cellule all'interno del pozzetto, che simula il sito della ferita.

Integrare accuratamente il pozzetto con il terreno di coltura senza disturbare il cerotto della ferita.

Prendi un inserto membranoso contenente una coltura aderente di cellule della cresta neurale, o NCC - cellule secretorie - in un terreno adatto. Posizionare l'inserto all'interno del pozzetto, in modo che gli NCC alla base siano vicini al cerotto della ferita. Incubare la co-coltura per la durata desiderata.

Durante l'incubazione, gli NCC rilasciano molecole di segnalazione che si legano ai recettori specifici sui mioblasti, avviando una cascata di segnalazione. Questa segnalazione facilita la riorganizzazione dell'actina nei mioblasti e, di conseguenza, queste cellule sviluppano proiezioni citoplasmatiche come lamellipodi e filopodi, ai loro bordi. Queste proiezioni aiutano i mioblasti a migrare verso l'area ferita e a ripopolarsi gradualmente, portando alla guarigione delle ferite.

Posizionare la piastra al microscopio e osservare la guarigione della ferita, la cui entità è correlata alla capacità migratoria dei mioblasti in co-coltura.

Quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza, rimuovere il mezzo surnatante dal pozzetto della camera C2C12 e lavare le cellule una volta con PBS.

Dopo aver rimosso il PBS, iniziare a grattare le cellule passando saldamente una punta di pipetta sterile P10, in un'unica direzione per coprire l'intera lunghezza o larghezza del monostrato cellulare. Una volta che le cellule sono state grattate, aggiungere rapidamente 1 millilitro di PBS.

Quindi, accendi il computer e il microscopio. Posizionare il vetrino della camera sul tavolino e ruotare la manopola dell'obiettivo su un ingrandimento 5X. Aprire il software di imaging, fare clic sulla scheda "Fotocamera", quindi fare clic sul pulsante "Live" per visualizzare le celle nella scheda "AxioCam IC".

Assicurarsi che il filtro della luce sia estratto completamente per consentire alla luce di passare alla fotocamera e allo schermo del computer. Spostare o ruotare manualmente il vetrino della camera per posizionare l'area della ferita al centro dell'immagine dal vivo nella scheda "AxioCam IC". Per scattare immagini, fai clic su "Snap" per aprire una scheda "Nuovo" accanto alla scheda "AxioCam IC" che contiene l'immagine.

Per salvare questa immagine fissa, fai clic su "File", seleziona "Salva con nome", seleziona "Desktop" sulla barra a sinistra per salvare il file sul desktop. Immettere il "Nome file" nella casella del nome del file e salvare la figura in formato file ".czi".

Per salvare l'immagine come ".tiff", fare clic su "File", selezionare "Salva con nome", inserire il "Nome file" nella casella del nome del file, fare clic sul pulsante "Salva come-Tipo" e selezionare "*.tiff" dal menu a discesa.

Riposizionare manualmente il vetrino della camera per scattare altre due o tre immagini in altri punti della ferita nello stesso pozzetto. Dopo l'imaging, rimuovere il PBS da ciascun pozzetto e aggiungere 1 millilitro di terreno C2C12.

Assemblare il sistema di co-coltura con inserto a pozzetto posizionando manualmente gli inserti contenenti le cellule O9-1 in ciascun pozzetto della camera. Delicatamente, spingere gli inserti verso il basso nel pozzetto in modo che la parte inferiore dell'inserto si trovi appena sopra le cellule C2C12 sottostanti. Rimetti i costrutti inseriti nell'incubatore e lascia che le cellule migrino per un totale di 9-12 ore.

Per determinare il tempo di migrazione ottimale, controllare le cellule sei ore dopo la creazione della ferita, quindi ogni due o tre ore. Termina l'esperimento quando le cellule in condizioni di controllo coprono completamente la ferita.