JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 2:57 min. • July 8th, 2025
Per suscitare una risposta immunitaria, gli antigeni si legano agli anticorpi specifici per i recettori endocitici presenti sulla superficie delle cellule dendritiche, o DC - le cellule presentanti l'antigene - che aiutano nell'assorbimento degli antigeni.
La formazione di un complesso anticorpo-antigene è un passaggio cruciale e può essere realizzata in vitro accoppiando chimicamente l'antigene a un anticorpo monoclonale mirato alla DC.
Per verificare l'efficienza del processo di coniugazione, iniziare con una piastra ELISA prerivestita con gli anticorpi catturati. Trattare la piastra con una soluzione bloccante per evitare il legame aspecifico degli antigeni alla superficie rivestita.
Aggiungere alla piastra coniugati anticorpo-antigene reticolati chimicamente e incubare. L'epitopo specifico dell'antigene interagisce con il paratopo dell'anticorpo catturato formando un complesso anticorpo-antigene-anticorpo.
Quindi, sovrapporre la piastra con una terza serie di anticorpi legati a un enzima. Questi anticorpi si legano specificamente agli anticorpi primari presenti nel coniugato, consentendone il rilevamento.
Aggiungere un tampone contenente il substrato cromogenico per visualizzare i coniugati. L'enzima attaccato all'anticorpo reagisce con il substrato, generando il prodotto colorato.
Trattare la piastra con una soluzione inattivante acidificata, che inattiva l'enzima e termina la reazione. Analizza la lastra spettrofotometricamente. La presenza di una soluzione colorata verifica la presenza di coniugati anticorpo-antigene e conferma il successo della coniugazione.
Per verificare il successo della coniugazione mediante ELISA, rivestire un'appropriata piastra ELISA da 96 pozzetti con 100 microlitri di anticorpo anti-OVA per pozzetto e diluire in serie l'anti-DEC-205/OVA in un rapporto 1:2 in tampone bloccante, per ottenere diluizioni da 6 microgrammi per millilitro a 93,8 nanogrammi per millilitro.
Aggiungere 100 microlitri di ciascuna diluizione nei pozzetti appropriati della piastra rivestita di anticorpi per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aggiungere 100 microlitri di anticorpo coniugato perossidasi di rafano contro il coniugato anti-DEC-205/OVA alla piastra per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente.
Quindi, aggiungere 50 microlitri di substrato di perossidasi di rafano a ciascun pozzetto, per consentire l'analisi della reazione del colore mediante spettrofotometria.