Perché la dipendenza dalla lattato deidrogenasi è importante per la validazione della proteina bersaglio?

Il saggio si basa sulla lattato deidrogenasi esogena per convertire il lattato in piruvato, garantendo che la generazione del segnale non sia influenzata da enzimi endogeni nel lisato. Questa dipendenza permette di attribuire in modo specifico il segnale colorimetrico alla concentrazione di lattato, supportando una valida conferma dell'obiettivo nei percorsi metabolici.

In che modo l'isolamento del lattato come variabile indipendente si inserisce nel percorso di scoperta?

Quantificando i livelli di lattato in funzione delle condizioni sperimentali, il saggio isola il lattato come parametro misurabile del flusso glicolitico, consentendo ai ricercatori di associare perturbazioni genetiche o farmacologiche a modifiche nel metabolismo energetico. Ciò favorisce la fase iniziale della scoperta fornendo un biomarcatore quantitativo e a ridotto rischio dell'attività della via metabolica.

A cosa permettono le misurazioni quantitative dell'assorbanza a 570 nm?

Le letture di assorbanza a 570 nm, dopo la sottrazione del fondo, vengono utilizzate per generare una curva standard a partire da concentrazioni note di lattato, consentendo l'interpolazione dei livelli di lattato nei campioni in esame. Questo risultato quantitativo permette l'analisi dose-risposta e il confronto tra gruppi sperimentali nelle campagne di screening.

Perché i requisiti di analisi duplicati sono importanti per la collaborazione trasversale?

Eseguire misurazioni duplicate per ogni campione aumenta l'affidabilità dei dati e riduce la varianza tecnica, elemento essenziale per un'interpretazione coerente tra team di biologia, screening e analisi. Questa pratica favorisce il passaggio riproducibile dei dati tra unità di scoperta e precliniche.

Quali capacità di analisi statistica sono richieste prima dell'implementazione?

I team devono essere in grado di generare una curva di calibrazione, eseguire una regressione lineare e interpolare le concentrazioni incognite dalla curva, seguite dalla correzione del fattore di diluizione (ad esempio, moltiplicando per 2,25 come indicato nel protocollo). Queste capacità garantiscono una quantificazione accurata del lattato a partire dai dati grezzi di assorbanza.

Saggio colorimetrico per la quantificazione del lattato nei campioni di prova

JoVE Encyclopedia of Experiments

Tecniche Biologiche

0 visualizzazioni • 3:08 min • July 8th, 2025

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Nelle cellule viventi, in condizioni anaerobiche, l'enzima lattato deidrogenasi converte il piruvato – un prodotto finale della glicolisi – in lattato – un metabolita chiave. La quantità di lattato prodotta nelle cellule riflette il loro stato metabolico.

Per quantificare la concentrazione intracellulare di lattato, iniziare con un campione di test di lisato di cellule di nematodi privo di proteine. Integrare altri pozzetti di una piastra a più pozzetti con una soluzione di lattato di varie concentrazioni note.

Il lisato è privo di tutti gli enzimi proteici, compresa la lattato deidrogenasi endogena, garantendo un'accurata quantificazione del lattato.

Aggiungere un tampone per il dosaggio del lattato in ciascun pozzetto per mantenere il pH appropriato per un'attività enzimatica ottimale. Integrare i pozzetti con una miscela di reazione contenente l'enzima lattato deidrogenasi, nicotinamide-adenina dinucleotide (NAD), un coenzima e una sonda colorimetrica e incubare.

Durante l'incubazione, la lattato deidrogenasi catalizza l'ossidazione del lattato cellulare a piruvato, con una contemporanea riduzione del NAD in NADH. Il NADH generato reagisce con la sonda colorimetrica per produrre un prodotto viola.

Misura spettroscopicamente l'assorbanza della soluzione viola per il campione di prova e gli standard di lattato a 570 nanometri. Tracciare i valori di assorbanza degli standard di lattato e generare la curva di calibrazione.

Infine, confrontare il valore di assorbanza del campione con gli standard di lattato per determinare la quantità di lattato presente nel campione di prova.

Per misurare la concentrazione di lattato, utilizzare un kit di test colorimetrico per eseguire l'analisi duplicata dei campioni di prova. Aggiungere 10 microlitri dei campioni di prova a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, quindi aggiungere un tampone per il dosaggio del lattato a ciascun campione per regolare il volume a 50 microlitri.

Diluire 100 millimolari di L(+)-Lattato standard con tampone per il dosaggio del lattato a 1 millimolare. Quindi, in una serie di pozzetti, aggiungere 0, 2, 4, 6, 8 e 10 microlitri di L(+)-Lattato standard diluito. Aggiungere 50 microlitri di miscela di reazione in ogni pozzetto e incubare a temperatura ambiente al riparo dalla luce per almeno 30 minuti affinché il colore si sviluppi.

Infine, utilizzare un lettore di micropiastre per misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 570 nanometri. Sottrarre l'assorbanza della miscela di controllo di fondo dall'assorbanza della miscela di reazione. Quindi, traccia la curva standard del lattato e calcola le concentrazioni di lattato dalla curva moltiplicando ciascuna concentrazione per 2,25.