Saggio colorimetrico per la quantificazione del lattato nei campioni di prova

Nelle cellule viventi, in condizioni anaerobiche, l'enzima lattato deidrogenasi converte il piruvato – un prodotto finale della glicolisi – in lattato – un metabolita chiave. La quantità di lattato prodotta nelle cellule riflette il loro stato metabolico.

Per quantificare la concentrazione intracellulare di lattato, iniziare con un campione di test di lisato di cellule di nematodi privo di proteine. Integrare altri pozzetti di una piastra a più pozzetti con una soluzione di lattato di varie concentrazioni note.

Il lisato è privo di tutti gli enzimi proteici, compresa la lattato deidrogenasi endogena, garantendo un'accurata quantificazione del lattato.

Aggiungere un tampone per il dosaggio del lattato in ciascun pozzetto per mantenere il pH appropriato per un'attività enzimatica ottimale. Integrare i pozzetti con una miscela di reazione contenente l'enzima lattato deidrogenasi, nicotinamide-adenina dinucleotide (NAD), un coenzima e una sonda colorimetrica e incubare.

Durante l'incubazione, la lattato deidrogenasi catalizza l'ossidazione del lattato cellulare a piruvato, con una contemporanea riduzione del NAD in NADH. Il NADH generato reagisce con la sonda colorimetrica per produrre