JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 2:29 min. • July 8th, 2025
I livelli cellulari di piruvato, un intermedio chiave nei percorsi biochimici che producono energia, possono essere stimati utilizzando saggi colorimetrici basati su enzimi.
Per determinare i livelli di piruvato nelle cellule di Caenorhabditis elegans, un nematode non parassita, si prende una frazione cellulare preparata da vermi adulti contenenti piruvato. Trattare la soluzione, rimuovendo le proteine cellulari, e raccogliere la frazione cellulare chiarificata - il campione di prova - contenente piruvato. L'assenza di proteine cellulari garantisce una determinazione accurata dei livelli di piruvato.
Inizia aggiungendo un reagente funzionante contenente gli enzimi piruvato ossidasi e perossidasi di rafano e un colorante cromogenico. Incubare la miscela al buio per una durata adeguata.
Durante l'incubazione, la piruvato ossidasi reagisce con il piruvato - il suo substrato - generando perossido di idrogeno come sottoprodotto. L'assenza di luce impedisce la decomposizione spontanea del perossido di idrogeno.
La perossidasi di rafano catalizza la reazione tra il perossido di idrogeno e il colorante cromogenico, producendo un prodotto colorato. L'intensità del prodotto di reazione color
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