JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 2:29 min • July 8th, 2025
I livelli cellulari di piruvato, un intermedio chiave nei percorsi biochimici che producono energia, possono essere stimati utilizzando saggi colorimetrici basati su enzimi.
Per determinare i livelli di piruvato nelle cellule di Caenorhabditis elegans, un nematode non parassita, si prende una frazione cellulare preparata da vermi adulti contenenti piruvato. Trattare la soluzione, rimuovendo le proteine cellulari, e raccogliere la frazione cellulare chiarificata - il campione di prova - contenente piruvato. L'assenza di proteine cellulari garantisce una determinazione accurata dei livelli di piruvato.
Inizia aggiungendo un reagente funzionante contenente gli enzimi piruvato ossidasi e perossidasi di rafano e un colorante cromogenico. Incubare la miscela al buio per una durata adeguata.
Durante l'incubazione, la piruvato ossidasi reagisce con il piruvato - il suo substrato - generando perossido di idrogeno come sottoprodotto. L'assenza di luce impedisce la decomposizione spontanea del perossido di idrogeno.
La perossidasi di rafano catalizza la reazione tra il perossido di idrogeno e il colorante cromogenico, producendo un prodotto colorato. L'intensità del prodotto di reazione colorato è direttamente proporzionale alla concentrazione di piruvato nel campione.
Al termine del periodo di incubazione, posizionare il campione all'interno di un lettore di piastre e misurare l'assorbanza. Generare una curva standard utilizzando una diluizione seriale con concentrazioni note di piruvato.
Tracciare il valore di assorbanza misurato del campione di prova sulla curva per determinare la concentrazione di piruvato nel campione di prova.
Utilizzare un kit di test colorimetrici per misurare la concentrazione di piruvato nei campioni di prova ed eseguire esami duplex.
Aggiungere 10 microlitri dei campioni di prova a diversi pozzetti di una piastra a 96 pozzetti e aggiungere 90 microlitri di reagente di lavoro a ciascun campione. Incubare coperto per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, posizionare la piastra in un lettore di micropiastre per misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 570 nanometri.
Traccia la curva standard del piruvato e calcola le concentrazioni di piruvato dalla curva standard moltiplicando ciascuna concentrazione per 2,25.
Questo articolo descrive un metodo per stimare i livelli cellulari di piruvato in Caenorhabditis elegans mediante saggi colorimetrici basati su enzimi. Il processo prevede la preparazione di una frazione cellulare, il trattamento per rimuovere le proteine e la misurazione dell'assorbanza per determinare la concentrazione di piruvato.
La misurazione quantitativa del piruvato nelle frazioni cellulari consente un profilo metabolico preciso in sistemi modello preclinici. Questo saggio colorimetrico supporta i team della fase iniziale di scoperta fornendo dati affidabili e riproducibili sugli intermedi metabolici, contribuendo alla validazione degli obiettivi e all'analisi dei percorsi metabolici. Una quantificazione accurata del piruvato rafforza la previsione dell'efficacia della modulazione dei percorsi metabolici nei portafogli di ricerca traslazionale.
Questo saggio colorimetrico del piruvato si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, supportando sia la verifica iniziale delle ipotesi sia la validazione successiva di bersagli metabolici.
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Ultimo aggiornamento: 22 agosto 2026